血清酶類測定

血清酶類測定第1頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二酶（enzyme）的本質：高度特異性、高度不穩(wěn)定性，高效性、可調節(jié)性酶的應用：由活細胞產生的能高效催化特異生化反應的蛋白質，屬于生物催化劑酶的特點：酶活性的檢測、代謝物的酶學分析和同工酶及亞型測定用于臨床診斷和療效判斷第2頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二一、酶活性定義：酶活性（enzymeactivity）也稱為酶活力，指酶促反應速率，即規(guī)定條件下在單位時間內產物的生成量或底物的減少量。表示方法：

或

式中v：反應速率，[P]：產物濃度，t：時間，[S]：底物濃度。第3頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二二、酶活性單位與酶活性濃度（一）酶活性單位定義：表示酶的相對含量，指在一定條件下，單位時間內生成一定量的產物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：慣用單位（一定的反應量/一定的反應時間）國際單位IU（μmol/min）Katal單位（mol/s）第4頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二1．慣用單位：20世紀60年代以前根據酶活性測定方法建立者的姓氏命名的單位ALP的金氏單位（King）氨基移轉酶的卡門氏單位（Karmen）特點：各單位對溫度、時間、物質量的定義不同，導致各測定值、參考范圍相差很大，彼此間無法比較,現在臨床應用較少。卡門氏單位：1.0ml血清在25℃，340nm，反應體積3.0ml,光徑1.0cm時每分鐘測定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4μmolNADH為一個卡門氏單位舉例：金氏單位：100ml血清ALP在37℃與底物作用15min，產生1mg酚。第5頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二2.國際單位IU（μmol/min）定義：在規(guī)定條件下（25℃及其他最適條件），每min催化1μmol底物轉變?yōu)楫a物的酶量，為1IU或1U，1IU=1μmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal單位定義：1Katal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol底物轉變?yōu)楫a物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU與Katal單位的關系：1katal=60×106IU，1IU=16.67nkatal第6頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（二）酶活性濃度酶活性濃度指單位體積樣本中的酶活性單位。國際單位用IU/L或U/L表示。酶活性濃度才具有臨床可比性，但其多數情況下都被不嚴格地稱為酶活性單位乃至酶活性.第7頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二三、酶促反應進程以產物生成量（或反應物減少量）為縱坐標、反應時間為橫坐標作圖所得到的一條曲線，稱為反應進程曲線（或反應時間曲線、速率曲線、時間曲線）t1t2時間t圖5-1酶促反應進程曲線吸光度A延滯期線性期非線性期第8頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（一）延滯期（lagphase、延遲期

）特點：為反應的初始階段，反應速率一開始時較慢，通常為幾秒到幾分鐘t1t2時間t圖5-1酶促反應進程曲線吸光度A線性期非線性期R1R2延滯期孵育期延滯期第9頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（二）線性期此階段酶促反應速率基本保持恒定；對底物而言，為反應速率與底物濃度[S]的零次方成正比的零級反應，即不受底物濃度的影響，而只與酶活性濃度成正比；

此時底物的消耗量小于5%，反應速率為反應初速率。酶活性濃度越高，線性期就越短

線性度：判斷線性期的一個指標，指吸光度（A）相對于時間（min）變化的可以接受的程度。線性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％線性度值越小則線性越好。一般判斷標準：不大于15％，否則判為非線性特點：可代表酶促反應速度第10頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（三）非線性期（偏離線性期、平坦期）進入非線性期的原因：反應的不斷進行，底物消耗越來越多，酶變性失活增加、可逆反應增強、產物抑制增加等使得反應速率明顯下降。特點：若為單底物的反應，則此時反應速率與單底物濃度[S]的一次方成正比，為一級反應。第11頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（一）酶促反應酶促反應式米氏方程：K4第12頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（二）Km的含義與意義1．Km的含義:

當Km=[S]時，，可見Km值等于反應速率達到最大反應速率Vmax一半時的底物濃度。2．Km的意義Km是酶的一個特征性常數（其他如等電點），Km的大小只與酶的性質有關反映酶對底物親和力的大小選擇酶的最適底物或天然底物計算不同底物濃度時的反應程度鑒別酶的種類判斷可逆反應的速率判斷酶偶聯(lián)反應的限速反應計算工具酶的用量第13頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（三）Vmax的含義定義：Vmax表示在一定酶量時的最大反應速率，即酶完全被底物所飽和時的反應速率，與酶活性濃度呈正比。應用：計算酶的轉換數（TN，催化常數Kcat）單位時間內每個酶分子將底物分子轉換成產物的最大值。計算公式為：

(單位是s-1)計算時要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致）第14頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)酶活性的測定測定方法分類：

按照儀器檢測方法分類：分光光度法、濁度法、熒光法、放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。按照反應時間分類；分為定時法、連續(xù)監(jiān)測法和平衡法。按照檢測對象分類：分為直接法和間接法。第15頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二一、按照反應時間分類的酶活性測定方法（一）定時法原理：定時法是固定時間法的簡稱，是指測定反應開始后一段時間（t1～t2）產物的增加量或底物的減少量以測定酶活性的方法。該方法一般需要在反應進行到一定時間后用強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止反應。特點：優(yōu)點：簡單，因為最后測定時酶促反應已被終止，故比色時不需要保溫設備，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活性的影響。缺點：如果不做預試驗則無法了解其酶促反應進程（t1-t2）是否為零級反應，故難以確保測定結果的準確性。吸光度At1t2

時間t圖5-6定時法的三種反應進程231定時法與兩點法、終點法的區(qū)別第16頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（二）連續(xù)監(jiān)測法原理：連續(xù)監(jiān)測法是指在多個時間點連續(xù)測定產物（或底物）在線性期內的生成量（或消耗量）即零級反應速率以測定酶活性的方法，又稱速率法、零級反應速率法、斜率法。該方法是在一定的反應時間區(qū)段內（至少9～120s）每隔一定時間（常為2～30s）讀取一次吸光度值，連續(xù)測定多點（至少4點），然后對吸光度數據作最小二乘法處理，再用線性期內的數據計算單位時間內的反應速率△A/min，最后據式計算出酶活性。第17頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第18頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)概述第19頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血漿特異酶

在血漿中發(fā)揮特定的催化作用的酶稱為血漿特異性酶，亦稱血漿功能性酶。多數由肝臟合成并以酶原形式分泌入血，在一定條件下被激活起作用。與凝血有關的酶或酶原：ChE、銅藍蛋白及脂蛋白脂肪酶等。外分泌酶

由外分泌腺合成并分泌進入血漿的酶稱外分泌酶,參與食物的消化過程，正常血液中含量很少。包括P-AMY、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。

細胞酶

存在于細胞內進行物質代謝的酶。隨著細胞的不斷更新或破壞可少量釋入血液。當其大量出現于血清中時，提示酶的來源組織細胞受損，最常用于臨床診斷。一、血清酶的來源

第20頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二二、酶活性測定在臨床診斷中的應用

由于酶廣泛分布于全身各器官、組織，所以酶活性的測定用于消化系統(tǒng)、心血管、骨骼、肌肉、腎等器官和組織的疾病與惡性腫瘤的診斷。第21頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（一）在診斷肝膽疾病中的應用肝是機體新陳代謝最活躍的器官，這是由于肝細胞中含有最豐富的酶類。

肝酶譜：AST、ALT、GGT、ALP、TP、ALB、GLB、

TBILI、DBILI、IBILI、CHE主要是用來判斷有無肝實質細胞損傷、肝內外膽汁淤積等肝膽疾病。ALT被認為是肝細胞損傷最敏感的指標之一。CHE在急性肝炎、肝硬化、農藥中毒時，可降至正常30%~50%。GGT、ALP等酶主要用于膽道疾病特別是膽道梗阻時的臨床診斷。單胺氧化酶（MAO）是結締組織中的酶類，其活性測定可用于肝纖維化程度的判斷。第22頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（二）在診斷心肌梗死中的應用用于診斷心肌梗死的血清酶主要有AST、LDH、CK、CK-MB和α-HBD。AST廣泛分布于機體各組織中，但在心肌中含量最多。LDH是低度特異性酶，LDH1在心肌中含量最高，

LDH2酶活性>LDH1

當心肌梗死時，LDH1>>LDH2CK-MB在診斷心肌梗死最佳的血清酶指標。當心肌梗死時，CK-MB可增高10~25倍。m-AST（線粒體型天門冬氨酸氨基轉移酶）與心肌梗死并發(fā)心力衰竭的發(fā)病率和死亡率有正比關系。第23頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（三）在診斷胰腺疾病中的應用用于急性胰腺炎的診斷和鑒別診斷的酶有AMY及其同工酶、LPS(脂肪酶)等。均來自胰腺泡的分泌。AMY

在急性胰腺炎時，顯著升高。注意：伴有高血脂的急性胰腺炎和靜止性胰腺炎時，AMY

活性正常。LPS在診斷胰腺炎特異性較高，但尿液中檢測不到LPS。第24頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（四）在診斷骨骼疾病中的應用ALP

是各種骨骼疾病最重要的酶學診斷指標

當發(fā)生骨骼肌疾病時，特別是成骨肉瘤、畸形骨炎，可分別增至正常的45倍與30倍。第25頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（五）在診斷前列腺疾病中的應用ACP(堿性磷酸酶)用于診斷前列腺疾病，特別是診斷前列腺癌的最重要指標。主要分布于前列腺、紅細胞、血小板等，成年男子血清中

1/3~1/2的ACP來自于前列腺。第26頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二（六）在診斷腫瘤中的應用具有器官特異性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特異性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及組織癌變過程中，與細胞正常分化、增殖功能有關的酶或同工酶活性下降，并出現腫瘤組織中的同工酶升高。第27頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清酶的生理變異

1.性別少數酶如CK、ALP及GGT等有性別差異，與血清酶的來源組織有關。2.年齡血清酶的活性隨年齡而變化，ALP和GGT到老年時可有輕度升高。年齡差異也見于同工酶。3.進食過量飲酒可使血清GGT明顯升高。4.運動多種血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等，其升高的幅度與運動量、持續(xù)時間、運動頻率及骨骼肌所含的酶量有關。5.妊娠胎盤組織可分泌一些酶進入母體血液，如耐熱ALP、LDH、LAP和ALT（少數）等，引起血清中這些酶活性升高。6.其他一些酶活性與體重、身高的增長、體位改變、晝夜變化及家庭因素有關。第28頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二酶的區(qū)域化分布血清酶符號來源丙氨酸氨基轉移酶門冬氨酸氨基轉移酶肌酸激酶乳酸脫氫酶堿性磷酸酶酸性磷酸酶-谷氨酰轉移酶5-核苷酸酶單胺氧化酶-淀粉酶脂肪酶谷氨酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶膽堿酯酶山梨醇脫氫酶鳥氨酸氨基甲酰轉移酶卵磷脂膽固醇?；D移酶ALTASTCKLDHALPACP-GT或GGT5-NTMAOAMS或AMYLPSGLDHICDCHESDHOCTLCAT肝、腎、心心、肝、骨骼肌骨骼肌、心、腦心、腎、骨骼肌、肝、肺小腸、胎盤、肝、腎前列腺、紅細胞、血小板肝、膽、腎、小腸肝、膽道肝、腎、腦胰、唾液腺胰肝肝、胎盤、心肝肝肝肝第29頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)臨床常用血清酶活性測定第30頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二標本（血清或血漿）

臨床酶學測定酶之前，標本還要經過采集、分離和儲存等一系列處理過程。而酶在血中處于一個動態(tài)變化過程，血液離開機體后還會有一定變化。因此在其中任何一個階段處理不當，都有可能引起測定值的變化。第31頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二標本應避免溶血：大多數酶在血細胞中的含量比在血漿中高得多

，少量血細胞的破壞就可能引起血漿中酶明顯升高。如紅細胞內的LD、AST和ALT活性分別較血清中高150、15和7倍左右，故測定這些酶時，樣品應避免溶血。及時分離血清（血漿）：靜脈采血后，必須在1-2h內及時離心，將血清與血細胞、血凝塊分離，以免血細胞中的酶通過細胞膜進入血清而引起誤差。第32頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二盡量用血清標本：

大多數抗凝劑都在一定程度上影響酶活性，臨床上除非測定與凝血或纖溶有關的酶，一般都應以血清作為首選測定標本。

及時測定，如不能及時測定，應放入冰箱保存（但有些標本不能冷凍）

為防止酶蛋白變性，一般至少應在血清分離后的當天進行測定，否則應放冰箱冷藏

有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低溫(特別是20℃冰凍)可引起不可逆性失活，反而不如室溫穩(wěn)定（“冷變性”）。第33頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)、氨基轉移酶活性測定氨基轉移酶又稱轉氨酶，在機體內多達60余種，廣泛存在于肝臟、心肌、骨骼肌、腎、腦、胰、肺、白細胞、紅細胞中。其中以丙氨酸氨基轉移酶(ALT或GPT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST或GOT)兩種最為重要，它們催化機體內氨基酸的轉氨基反應：

ALTL-丙氨酸

+α-酮戊二酸?丙酮酸

+L-谷氨酸

ASTL-天門冬氨酸

+α-酮戊二酸?草酰乙酸

+L-谷氨酸

A-NH2+BA+B-NH2轉氨酶第34頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二1.賴氏比色法選擇在500-520nm處檢測，丙酮酸苯腙的顯色強度約為α-酮戊二酸苯腙的3倍必須降低底物α-酮戊二酸及2,4-二硝基苯肼的濃度ALT測定不是在最佳條件下進行，反應中丙酮酸生成量與ALT活性不能呈現良好的線性關系(這是賴氏法的最大缺陷)，其標準曲線不呈直線而為拋物線。2,4-二硝基苯肼丙酮酸苯腙(在堿性條件下呈紅棕色)α-酮戊二酸苯腙(在堿性條件下呈紅棕色)丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT37°pH7.4丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性測定第35頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二試劑與器材1、0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液2、0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液3、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.4）4、底物緩沖液5、1.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液6、0.4mol/L氫氧化鈉溶液7、2mmol/L丙酮酸標準液8、器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計、坐標紙。第36頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實踐步驟加入物（ml）測定管對照管

血清0.10.1

底物緩沖液0.5-

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫30min2，4-二硝基苯肼溶液0.50.5底物緩沖液-0.5混勻后，置37℃水浴保溫20min，每管加入0.4mol/LNaOH5.0ml，混勻，室溫放置5min，用分光光度計在波長505nm處，以蒸餾水調零，讀取各管吸光度。

第37頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二參考范圍：5-25卡門單位注意事項1.血清ALT在室溫（25℃）可以保存2d，在4℃冰箱可保存2周，在-20℃可保存1個月。2.嚴重脂血、黃疸、溶血血清可增加測定的吸光度。3.糖尿病酮癥酸中毒病人血中因含有大量酮體，能與2，4-二硝基苯肼溶液作用呈色，引起吸光度增加，因此，此類標本應做對照管。第38頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二方法評價操作簡便，不需要紫外分光光度計，易于普及，所用的酶活性單位通過卡門氏分光光度速率法矯正，使其結果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實活性。故衛(wèi)生部臨檢中心建議國內無條件使用連續(xù)監(jiān)測法的單位使用賴氏法。不適用自動分析儀；試劑穩(wěn)定性差，底物緩沖液不易保存(易長菌)；由于賴氏法必須降低底物α-酮戊二酸及2，4-二硝基苯肼的濃度，造成ALT測定不是在最佳條件下進行，反應中丙酮酸生成量與ALT活性不能呈現良好的線性關系，這是賴氏法的最大缺陷。第39頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二(二)速率法轉氨酶的測定多用比色法，以賴氏法最常用。目前，國內外實驗室多采用連續(xù)監(jiān)測法進行測定。ALT速率法測定中酶偶聯(lián)反應式為：

ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸L-谷氨酸+L-丙酮酸

LD丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+上述偶聯(lián)反應中，NADH的氧化速率與標本中酶活性呈正比，可在340nm檢測吸光度下降速率。根據線性反應期吸光度下降速率(-△A／min)，計算出ALT的活性濃度。第40頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]速率法：男性：5～40U/L女性：5～35U/L

第41頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二ALT廣泛分布于全身各組織器官，尤以肝細胞中含量最多，其次是腎臟、心臟及骨骼肌，通常只有極少量釋放入血液，所以血清中此酶的活力很低，當這些組織病變時，細胞壞死或通透性增加，細胞內酶大量釋放入血，使血清中該酶活力顯著增高。[臨床意義](1)肝膽疾病：急性病毒性肝炎、慢性活動型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬變活動期、中毒性肝炎、膽結石、膽管炎和膽囊炎等。(2)心血管疾?。杭毙孕募」Ｋ馈⒓毙孕募⊙?、急性心力衰竭、腦出血等。(3)骨骼肌疾?。憾喟l(fā)性肌炎、進行性肌營養(yǎng)不良等。（4）一些藥物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、異菸肼、苯巴比妥、奎寧、水楊酸制劑及酒精、鉛、汞、四氯化碳或有機磷等

第42頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二ALT在肝臟疾病中的應用價值ALT急性明顯升高，常達200U以上，病情較重者可達400-600U以上，甚至更高，個別重型病人甚至可超過1000U。ALT越高，肝臟細胞損害越嚴重。慢性活動性肝炎：ALT持續(xù)輕度升高幾十或100U以上（100～200U）慢性肝炎急性肝炎重型肝炎由于肝細胞發(fā)生大量變性，壞死，使ALT大量進入血液，因此，ALT迅速升高，高達數百～1000U以上，如果ALT含量越高，上升越快，說明肝細胞壞死嚴重，病情進展也越快。當病情發(fā)展到一定的嚴重程度，肝細胞大量壞死，肝臟生產ALT的能力喪失，這時血液中的ALT降低，但是黃疸卻持續(xù)升高（膽紅素上升），這種現象即所謂“酶膽分離”，往往提示病情正在惡化，常是肝壞死征兆。第43頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二ALT增高程度與肝硬化的活動度和肝組織炎癥改變及肝細胞損害程度相一致。對ALT進行監(jiān)測有助于對肝硬化病情的判斷。若是靜止性肝硬化，則ALT維持正常；肝硬化病人的轉氨酶出現較大幅度的升高，提示病情可能發(fā)展成活動性，須引起警惕。肝硬化肝癌80%—90%肝細胞都是在肝硬化基礎上發(fā)生的，因此，在早期，ALT是否增高主要決定于肝硬化的活動程度。若是靜止性肝硬化，則ALT維持正常，因為肝細胞發(fā)生癌變時，細胞并沒有壞死破壞，ALT沒有釋放出來，因此，ALT沒有升高，或ALT有輕度或中度增高。第44頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清天冬氨酸氨基轉移酶（AST）活性測定[測定方法]一、速率法（連續(xù)監(jiān)測法）NADH在340nm處有特征吸收峰，連續(xù)監(jiān)測NADH消耗引起的340nm吸光度變化,根據340nm處吸光度下降速率（－△A/min）計算AST活性參考方法第45頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二

ASTL-天門冬氨酸+α-酮戊二酸?草酰乙酸+L-谷氨酸自發(fā)↓脫羧丙酮酸（二）賴氏比色法第46頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]賴氏比色法：

8～28卡門單位（反應溫度為37℃）速率法：8～40U/L（反應溫度為37℃，試劑不含P5P）

第47頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[臨床意義]1.AST廣泛分布于全身各組織器官，在心肌細胞內含量最多，當心肌梗死時，血清中AST活力增高，在發(fā)病后6～12h之內顯著增高，在48h達到高峰，約在3～5d恢復正常。2.血清中的AST也可來源于肝細胞，各種肝病可引起血清AST的升高，有時可達1200卡門單位，中毒性肝炎還可更高。3.肌炎、胸膜炎、腎炎及肺炎等也可引起血清AST的輕度增高。第48頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二AST/ALT比值大小有助于臨床判斷肝病嚴重程度急性肝炎的AST/ALT均值為0.56:1肝硬化的AST/ALT均值為1.13：1肝癌組AST/ALT均值為2.41：1急性肝壞死組AST/ALT均值為3.61：1肝細胞中的總含量：AST（主要存在于肝細胞線粒體內）＞ALT（主要存在于肝細胞胞漿內）肝細胞輕度損傷時主要是胞漿酶釋放出來，血清中ALT＞AST；而肝細胞重度損傷時胞漿酶、線粒體酶均釋放出來，血清中AST＞＞ALT；隨著肝病由輕變重，AST/ALT的比值就由＜1變?yōu)椋?第49頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)血清r-谷氨?；D移酶測定第50頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清-谷氨酰轉移酶（GGT）活性測定

GGT是催化-谷氨酰基移換反應的一種酶GGT分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。

GGT在肝臟中廣泛分布于肝細胞的毛細膽管一側和整個膽管系統(tǒng)，因此當肝內合成亢進或膽汁排出受阻時，血清中GGT增高。

第51頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二以γ-谷氨酰α-萘胺作為γ-谷氨?；墓w，雙甘肽作為受體，在GGT作用下，產生α-萘胺，后者與重氮試劑反應，產生紅色α-萘胺-對-偶氮苯磺酸，其色澤的深淺與GGT活力成正比。一、重氮反應比色法原理第52頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二試劑與器材1.150mmol/L雙甘肽溶液2.1mol/LHCL3.底物緩沖液4.2g/L對氨基苯磺酸醋酸溶液5.1.0g/L亞硝酸鈉溶液6.顯色劑7.1.5mmol/La-萘胺標準貯存液8.0.15mmol/La-萘胺標準應用液9.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計、坐標紙。第53頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實踐步驟加入物（ml）測定管對照管

血清0.05-

底物緩沖液0.50.5

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min顯色劑0.50.5血清-0.05混勻后，置37℃水浴保溫10min，用分光光度計在波長530nm處，以對照管調零，讀取各管吸光度。

第54頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二參考范圍：成年男性3~17U/L

成年女性2~13U/L第55頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[測定方法]一、速率法以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺為底物，雙甘肽為谷氨?；氖荏w，在GGT的催化下，谷氨?；D移到雙甘肽分子上，同時釋放出黃色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，根據405nm處吸光度增加的速率（△A/min）推算出GGT活性單位原理第56頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二參考范圍：成年男性11~50U/L

成年女性7~32U/L第57頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二注意事項溶血標本，>500mg/L以上可使活性減低，黃疸及脂血標本不干擾本法測定結果。血清中GGT的活性，在室溫或4℃可穩(wěn)定7天，在冷凍狀態(tài)下可穩(wěn)定2個月。第58頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二生物化學特征

γ－谷氨酰轉移酶(γ-GT或GGT)又稱γ-谷氨酰轉肽酶，是一種線粒體酶。組織分布以腎臟含量最多，其次為胰、肺、肝等。γ-GT是肝膽疾病檢出陽性率最高的酶。膽道疾病如膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻時，γ-GT不僅陽性率高，而且升高明顯。γ-GT還可用于判斷惡性腫瘤有無肝轉移，腫瘤患者如有γ-GT的升高，常說明有肝轉移。

γ-GT與乙醇的攝取量有關，飲酒時，由于乙醇對肝細胞線粒體的誘導導致γ-GT活性升高，故對乙醇性中毒的判定有相當的價值。長期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者常有γ-GT升高。第59頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)血清（尿）淀粉酶測定第60頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清淀粉酶（AMS/AMY）活性測定人和動物只含α-AMY，此酶以Ca2+為必需因子（除肝素外，各種抗凝劑可通過螯合Ca2+

抑制AMS活性，故標本必須用血清或肝素抗凝血漿）.血清中的AMS主要有胰型(P型)和唾液型(S型)及其亞型同工酶組成人體中胰腺含AMY最多，唾液腺也分泌大量AMY。

AMY分子量較小，易由腎臟排出，半壽期很短（約2h），所以病變時血清AMY增高持續(xù)時間很短。第61頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[測定方法]天然淀粉底物方法：（分子組成）確定底物方法：碘-淀粉比色法

目前應用最多的方法是以人工合成的麥芽多糖為底物的方法第62頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二二、碘-淀粉比色法原理α-淀粉酶淀粉葡萄糖+麥芽糖+糊精+碘液蘭色復合物血清(尿)中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4-糖苷鍵，水解產生葡萄糖、麥芽糖及含有α-1，6-糖苷鍵支鏈的糊精。在底物充分（已知濃度）的條件下，反應后加入碘液與未被水解的淀粉結合，生成藍色復合物，其藍色的深淺與未經酶促反應的空白管(此處亦相當于標準管)比較，從而推算出AMS的活力單位。第63頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二試劑與器材1.0.4g/L緩沖淀粉溶液2.0.1mol/L碘貯存液3.0.01mol/L碘應用液4.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時鐘、分光光度計。第64頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實踐步驟先用生理鹽水將血清作10倍稀釋（尿液20倍稀釋）加入物（ml）測定管對照管緩沖淀粉溶液(37℃預溫5min)1.01.0稀釋血清(稀釋尿液）0.2-

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫7.5min碘應用液1.01.0蒸餾水6.06.2混勻后，用分光光度計在波長660nm處，以蒸餾水調零，讀取各管吸光度。

第65頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二成本低、檢測不需要昂貴儀器、試劑穩(wěn)定、操作簡便；但重復性差、準確率低方法評價：第66頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]碘-淀粉比色法：第67頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[臨床意義]血清(尿)AMS活性是診斷胰腺疾病的重要指標。

升高

——急性胰腺炎、流行性腮腺炎；

——急性膽囊炎、腸梗阻、胰腺癌、膽石癥、潰瘍病穿孔及嗎啡注射后。降低

——肝炎、肝硬化、肝癌；

——腎功能障礙。第68頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二急性胰腺炎時血、尿淀粉酶升高的不同表現開始升高時間高峰時間恢復時間血清8-12h12-24h2-5d尿液12-24h5-7d1-2w第69頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第五節(jié)血清堿性磷酸酶測定第70頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清堿性磷酸酶（ALP）活性測定

ALP廣泛分布定位于細胞膜表面，其含量依次為肝、腎、胎盤、小腸、骨骼等。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼，主要用于診斷肝膽和骨骼疾病第71頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二一、比色法原理在pHl0的堿性條件下，ALP催化磷酸苯二鈉底物水解，生成游離的酚和磷酸氫二鈉。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林結合，并經鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌類衍生物，根據紅色深淺計算出ALP活力的大小。第72頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二試劑與器材1.0.1mol/L碳酸鹽緩沖液2.20mmol/L磷酸苯二鈉溶液3.鐵氰化鉀溶液4.酚標準貯存液5.酚標準應用液6.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時鐘、分光光度計。第73頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實踐步驟加入物（ml）測定管對照管

血清0.1-

碳酸鹽緩沖液1.01.0

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫5min底物液（預溫至37℃）1.01.0混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min鐵氰化鉀溶液顯色劑3.03.0血清-0.1混勻后，用分光光度計在波長510nm處，讀取各管吸光度。

第74頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二1.血清標本應新鮮，置室溫(25℃)6h測定，ALP活性約增高1

％；置室溫1～4d，ALP活性增高3％～6％；若冰凍保存，血清復溶后ALP活性升高可達30％。2．一般用血清與肝素抗凝血漿測定ALP活性?？鼓齽┤鏓DTA-

Na2、草酸鹽、檸檬酸鹽等因能絡合Mg2+而抑制ALP活性，故不能使用這類抗凝劑的血漿做于ALP活性測定。3．ALP測定受年齡與性別、飲食、運動和妊娠等因素的影響。

注意事項第75頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[測定方法]二、速率法原理以對-硝基苯酚磷酸鈉（PNPP）為底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇AMP或二乙醇胺（DEA）為磷酸?；氖荏w。在堿性條件下，ALP催化PNPP水解釋放出磷酸基團，生成游離對-硝基酚（PNP），PNP在堿性溶液中轉變成醌式結構，呈現較深的黃色。根據405nm處吸光度增加的速率（△A/min）推算出血清ALP活性單位。第76頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]金氏比色法：成人：3～13金氏單位，兒童：5～28金氏單位速率法：女性：1～12歲<500U/L

>15歲40～150U/L

男性：1～12歲<500U/L12～15歲<750U/L>25歲40～150U/L。

第77頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二ALP檢測主要用于診斷肝膽和骨骼疾病[臨床意義](1)肝膽系統(tǒng)疾?。焊鞣N肝內、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾?。篈LP明顯升高，且ALP升高與血清膽紅素升高相平行，肝內局限性膽道阻塞（如肝癌、肝膿腫）：ALP明顯增高，血清膽紅素大多正常。

累及肝實質細胞的肝膽疾?。ǜ窝?、肝硬化）：ALP輕度升高。(2)骨骼疾?。海?）妊娠后期及兒童生長期ALP生理性增高由于骨的損傷或疾病使成骨細胞內所含高濃度的ALP釋放入血液中，引起血清ALP活力的增高。如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉移癌和骨折修復愈合期等。第78頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第六節(jié)血清乳酸脫氫酶測定第79頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以骨骼肌、肝、心肌、腎含量較多，其次是脾、胰及肺組織中。組織中LDH活力約比血清高1000倍，紅細胞內LDH活力較血清約高100倍（溶血可引起LDH明顯升高）。LDH有5種同工酶。第80頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清乳酸脫氫酶（LDH）活性測定乳酸脫氫酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙酮酸，同時將氫轉移給輔酶NAD+而成為NADH。

L-乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+(氧化型輔酶1)(還原型輔酶1)pH8.8～9.8pH7.4～7.8第81頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二乳酸脫氫酶在有輔酶I(NAD+)存在的情況下，催化乳酸脫氫生成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應，生成丙酮酸-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色。其顏色深淺與丙酮酸濃度成正比，同樣處理丙酮酸標準液進行比色，即可求得LDH的活力單位。反應式如下：一、比色法原理

LDH乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+丙酮酸+2，4-二硝基苯肼丙酮酸-二硝基苯腙

+H2ONaOH第82頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二試劑與器材1.底物緩沖液2.11.3mmol/LNAD+

溶液3.1mmol/L

2，4-二硝基苯肼4.0.4mol/LNaOH5.0.5mmol/L丙酮酸標準液6.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度計、坐標紙。第83頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實踐步驟加入物（ml）測定管對照管

血清0.01

0.01

底物緩沖液0.5

0.5

混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫5minNAD+

溶液0.1

-混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15min2，4-二硝基苯肼0.5

0.5NAD+

溶液-0.1混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫15minNaOH溶液5.05.0混勻后，用分光光度計在波長440nm處，用蒸餾水調零，讀取各管吸光度。

第84頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二二、乳酸為底物的速率法（LD-L法）原理第85頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]速率法：109～245U／L比色法：190～437金氏單位第86頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二注意事項1.用血清或肝素抗凝血漿測定LDH活性的效果令人滿意，草酸鹽抗凝劑對LDH活性有抑制作用。標本應嚴格避免溶血。2.LDH4、LDH5對冷特別不穩(wěn)定(冷變性)，其活性在-20℃過夜就喪失，故標本不宜冰箱存放。血清標本室溫存放可穩(wěn)定2~3d。第87頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[臨床意義]LDH測定常用于心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤的輔助診斷。LDH與CK-MB、AST聯(lián)合可判定心肌梗死的病程。正常情況下，新生兒LDH含量較高，約為成人2倍，隨著年齡增長逐漸降低，至14歲時趨于穩(wěn)定。第88頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二LDH是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體，形成5種結構不同的同工酶。按電泳速度命名。臨床意義心肌，腎和紅細胞中以LDH1和LDH2最多骨骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺，脾，胰，甲狀腺，腎上腺和淋巴結等組織中以LDH3最多第89頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二LDH活力增高主要見于以下疾?。?．心血管疾病

LDH由于分子量較大，在常用心肌酶中升高最遲心肌梗死患者在發(fā)生胸痛后8～12hLDH開始升高24～48h達高峰升高水平通常為正常的3～4倍，最高可達10倍。LDH中度升高見于心肌炎，伴有肝淤血的心衰，重度休克及缺氧。2．肝病伴有黃疸的中毒性肝炎患者，LDH可達正常10倍。LDH升高亦可見于病毒性肝炎、傳染性單核細胞增多癥、肝硬化等。3．惡性腫瘤

70％有肝轉移的腫瘤患者及20％～60％無肝轉移的腫瘤患者有LDH水平升高?；羝娼鸩?、腹部及肺部腫瘤、胚胎細胞腫瘤、白血病等亦有LDH升高。4．其它疾病溶血性疾病、腎病、進行性肌營養(yǎng)不良、肺栓塞亦伴有LDH升高。第90頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第七節(jié)血清肌酸激酶測定第91頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清肌酸激酶（CK）活性測定肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉移的可逆性反應，反應平衡點與體系pH有關。

pH9.0Cr+ATPCrP+ADP

pH6.7(肌酸)(磷酸肌酸)CK廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。肝.紅細胞含有微量或不含CK，輕度溶血不影響結果。

第92頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[測定方法]測定方法有比色法（如肌酸顯色法）、速率法(酶偶聯(lián)法)和熒光分析法。其中以速率法最常用，有兩種工具酶及指示酶參與反應。IFCC測定CK的參考方法為速率法(酶偶聯(lián)法)

。

第93頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清肌酸激酶（CK）活性測定在肌酸激酶的催化下，磷酸肌酸與ADP反應生成肌酸和ATP，肌酸與雙乙酰、α-萘酚結合生成紅色化合物。這種紅色化合物在一定范圍內與肌酸量呈線性關系，在540nm波長處與同法處理的肌酸標準液比色，求得血清CK的活性。

pH6.7CrP+ADP

Cr+ATP

(磷酸肌酸)

(肌酸)第94頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二【試劑與儀器】

1．Tris-HCl緩沖液(pH7．4)2．12mmol／L磷酸肌酸溶液3．4mmol／LADP溶液4．混合底物溶液5.50g／L硫酸鋅溶液6.60/L氫氧化鋇溶液7．貯存堿液8．α-萘酚溶液9．雙乙酰溶液10．1.7mmol／L肌酸標準液11.器材試管、恒溫水浴箱、刻度吸管、微量移液器、定時鐘、分光光度計。第95頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二實驗步驟加入物(m1)空白管標準管測定管血清一一0.1

肌酸標準液一0．1一蒸餾水0．1一一混合底物液0．750．750．75

混勻，37℃水浴30分鐘氫氧化鋇溶液0．50．50．5

硫酸鋅溶液0．50．50．5

蒸餾水0．50．50．5

充分振蕩，混勻后離心(2000r／min)10分鐘，取上清液上述上清液0．50．50．5a一萘酚溶液1．01．01．0

雙乙酰溶液0．50．50．5

混勻，37℃水浴15~20分鐘蒸餾水2．52．52．5

混勻，在540nm波長處，以空白管調零，分別測定吸光度值。

第96頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二參考范圍8~60U/L第97頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二二、速率法(酶偶聯(lián)法)可在340nm波長下測定NADPH生成速率而計算CK活性濃度。第98頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[臨床意義]骨骼肌中CK含量較高，在各種類型的進行性肌萎縮時CK活性均可增高。臨床上主要用于診斷心肌梗死。急性心肌梗死后3～6h就開始急劇升高20～30h達高峰可高達正常上限的10～12倍CK對診斷心肌梗死較AST、LDH的特異性高但此酶增高持續(xù)時間短，在2～4d后就恢復正常病毒性心肌炎時，CK活力也明顯升高，對診斷及判斷預后有參考價值。CK總酶與CK同工酶聯(lián)合測定可判定CK的來源。CK、AST、LDH聯(lián)合測定有助于判定心肌梗死的病程。第99頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二第八節(jié)血清同工酶測定第100頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二臨床上常進行的同工酶測定有LDH、CK、AST、GGT、AMS等。LDH同工酶主要用于心肌梗死、肝病、惡性腫瘤和貧血的診斷。CK同工酶用于心肌梗死早期診斷、神經肌肉系統(tǒng)疾病。AST同工酶用來判斷細胞損傷程度ALP同工酶用于診斷肝膽系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤GGT同工酶用于診斷原發(fā)性及繼發(fā)性肝癌AMS同工酶有助于提高急性胰腺炎診斷的敏感性和特異性測定。第101頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二

同工酶測定的常用方法主要有電泳法、層析法、動力學法、免疫化學法等。本章主要介紹心肌酶譜中的LDH、CK、AST三種同工酶測定。第102頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二LDH是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體，形成5種結構不同的同工酶。按電泳速度命名。血清乳酸脫氫酶同工酶測定心肌，腎和紅細胞中以LDH1和LDH2最多骨骼肌和肝中以LDH4和LDH5最多肺，脾，胰，甲狀腺，腎上腺和淋巴結等組織中以LDH3最多第103頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[測定方法]測定LDH同工酶的方法主要有5類：①電泳法；②離子交換柱層析法；③免疫學法；④抑制劑法；⑤酶水解法等。其中電泳法為應用最早且目前應用最廣泛的方法，在電泳法中有瓊脂糖電泳法、乙酸纖維素膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳和全自動電泳（也是一種瓊脂糖電泳）等。+LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5第104頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二正常人體組織中LDH同工酶的組成及相對含量同工酶及亞基組成心肌肝骨骼肌紅細胞

LDH1(H4)602442LDH2(H3M)336744LDH3(H2M2)7151710LDH4(HM3)<113164LDH5(M4)<16456<1第105頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二參考范圍瓊脂糖電泳法：

LDH1（28.4±5.3）%；

LDH2（41.0±5.0）%；

LDH3（19.0±4.0）%；

LDH4（6.6±3.5）%；

LDH5（4.6±3.0）%。

醋酸纖維素薄膜法：

LDH1（25.32±2.62）%

LDH2（34.36±1.57）%

LDH3（21.86±1.38）%

LDH4（11.3±1.84）%

LDH5（7.97±1.59）%第106頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二臨床上測定LD同工酶有助于相應組織病變的診斷。[臨床意義]第107頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[參考區(qū)間]健康成年人血清中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LDl>LD3>LD4>LD5部分正常兒童血中可見LDl>LD2。第108頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二心肌梗死和心肌炎：以LD1和LD2升高為主，即所謂“反轉比率”現象，且持續(xù)的時間長，故為診斷AMI的一個特異指標。骨骼肌和肝細胞損傷：LDH5增高且LDH5＞LDH4，是診斷肝細胞壞死的敏感指標。其它：肺、胰、脾、淋巴結壞死和炎癥及各種惡性疾病時LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病時LD1和LD2升高，但仍為LD2>LD1；惡性腫瘤如轉移到肝臟往往伴有LD4、LD5升高。第109頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二血清肌酸激酶同工酶測定在細胞質有三種同工酶：

CK-BB（CK-1）腦型同工酶腦、前列腺、腸、肺、膀胱、子宮、胎盤及甲狀腺占優(yōu)勢，正常血清CK-BB含量極少，用一般方法測不出。

CK-MB（CK-2）心型同工酶主要分布于心肌中，正常血清含有少量的CK-MB，不超過總活性的5%。

CK-MM（CK-3）肌型同工酶（氧化型\中間型\還原型）（CK-MB1\CK-MB2）（CK-MM1\CK-MM2\CK-MM3）骨骼肌及心肌占優(yōu)勢，正常血清絕大部分為CK-MM的活性肌酸激酶（CK）分子是由M亞基和B亞基組成的二聚體。在細胞線粒體內的另一種同工酶：CK-Mt（CK-4）CK-Mt存在于細胞的線粒體膜上，在正常血清中CK-Mt是不出現的。當線粒體崩解時，線粒體膜的小碎片進入血液，故CK-Mt成低聚狀態(tài)。第110頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二CK同工酶亞型（CK-MM亞型和CK-MB亞型）多用瓊脂糖凝膠高壓電泳、離子交換層析法、免疫抑制法和放射免疫法。[測定方法]第111頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二免疫抑制法測定CK-MB亞型原理：用羊抗CK-M抗體與病人血清共同溫育，血清中的CK-M亞基全部被抑制，測定剩余的非CK-M活性，即代表CK-BB和CK-MB中的B亞基及CK-Mt活性。由于健康人和心臟、肌肉疾患病人血清中CK-BB和CK-Mt量極低，故一般忽略不計，這些樣品中的非CK-M活性實際上代表CK-MB中的B亞基活性，乘以2即為CK-MB活性。第112頁，共129頁，2023年，2月20日，星期二[臨床意義]不同組織受損、壞死，血清中就有不同的CK同工酶增高

血清中CK-MB升高是公認的診斷AMI和確定有無心肌壞死的重要指標此同工酶對心肌梗死的特異性可高達100％。CK-MB的特異性超過了AST、LDH、CK，甚至超過LDH1。急性心肌梗死發(fā)病2～4h后，血清CK-MB即開始上升

12～24h達到峰值如無并發(fā)癥3d后恢復至正常水平。若下降后的CK-MB再度上升，提示有心肌梗死復發(fā)。第113頁，共129頁，2023年，2月20日，星