實驗二細(xì)菌基因組DNA的提取課件

細(xì)菌基因組DNA的提取一、實驗原理1、核酸的分類DNA

主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA

存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。分離純化核酸總的原則：

①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；

②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則核酸制備時應(yīng)注意的事項:①盡量簡化操作步驟，縮短提取時間。②減少化學(xué)因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。

核酸酶的抑制和抑制劑

降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。3、核酸制備的一般方法和原理DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。

核酸制備中常用的去垢劑

核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核小體上的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉核酸制備中常用的酶

DNase

RNase

蛋白酶K

溶菌酶

細(xì)胞破碎

抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸核酸提取的一般過程核酸樣品的保存溫度：

4℃（5℃）最佳和最簡單-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、設(shè)備及試劑

菌種：大腸桿菌設(shè)備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，渦旋振蕩器，水浴鍋（37℃、60℃

）試劑：LB液體培養(yǎng)基、RNA酶A、無水乙醇無菌水（或TE）緩沖液、10%的SDS、20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/LNaCl、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、異丙醇、75%乙醇、CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加熱到65度溶解。）1、培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.2ml的培養(yǎng)物離心12000rpm,1min。2、沉淀物加入570ul的無菌水（或TE）緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30ul10%的SDS和10ul20mg/ml的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻，于60℃溫育10min。(上下顛倒混勻)，離心，12000rpm,5min。4、取上清，加入等體積（約800ul）的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000rpm,5min，將上清液轉(zhuǎn)至新管中。（抽提兩次）5、加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，靜止10分鐘，離心,12000rpm,10min。6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗滌，離心5min，棄上清液，重懸于30ul的無菌水（或TE）緩沖液。三、操作步驟四、注意事項——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩四、注意事項——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法四、注意事項——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70