FISH技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用課件

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熒光原位雜交（FISH）在血液腫瘤中的應(yīng)用FISH的定義

熒光原位雜交（FISH）是20世紀(jì)八十年代在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。它利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo)記或先以生物素或地高辛等半抗原標(biāo)記后與靶DNA進(jìn)行雜交，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)，從而對(duì)標(biāo)本中待測(cè)核酸進(jìn)行定性、定位和定量分析。FISH技術(shù)原理FISH技術(shù)原理FISH技術(shù)原理FISH技術(shù)原理FISH技術(shù)原理FISH的種類間期FISH（InterphaseFISH）染色體涂染分析（Chromosomepainting）多色FISH（Multicolor-FISH）反向涂染（Reversepainting）比較基因組雜交（Comparativegenomichybridization）FISH探針的種類和用途著絲粒探針用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常如三體、單體等。亞端粒探針靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測(cè)涉及端粒的隱匿性易位。染色體臂或整條染色體涂染探針（WCP）用于檢測(cè)染色體易位和標(biāo)記染色體。序列特異性探針包括臂、帶和基因探針等多種，用于檢測(cè)基因缺失和重排。FISH在血液腫瘤中的應(yīng)用檢測(cè)樣本可以是血液、骨髓、石蠟切片診斷和鑒別診斷治療和預(yù)后分層監(jiān)測(cè)療效（微小殘留病灶檢測(cè)）

識(shí)別移植后骨髓細(xì)胞來(lái)源一、診斷和鑒別診斷核型分析缺點(diǎn)：有絲分裂象少或缺如染色體質(zhì)量低劣，顯帶不佳染色體異常復(fù)雜分子生物學(xué)檢測(cè)不足：常見的轉(zhuǎn)錄序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度一般在100～700bp之間mRNA剪切方式比較特殊，假陰性結(jié)果，易造成漏診或誤診一、診斷和鑒別診斷FISH技術(shù)能彌補(bǔ)以上2種技術(shù)的不足之處間期細(xì)胞上分析（無(wú)需中期分裂象），極大地提高了敏感性、準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)核型提示的染色體異常做進(jìn)一步鑒定，從“正常核型”中篩查隱匿的染色體畸變，成為精確的染色體分析不可缺少的手段。FISH探針的片段相對(duì)較長(zhǎng)，?？蛇_(dá)數(shù)百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一側(cè)多個(gè)外顯子區(qū)域，只要發(fā)生在這些區(qū)域的缺失或易位都能被檢測(cè)到，極少發(fā)生漏檢，假陰性率很低。2006.5.4發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞增高至170×109，血小板511×109，血紅蛋白118g/dL。骨髓象顯示早幼粒細(xì)胞占6%，中幼粒細(xì)胞占13%，核型分析未見分裂象。BCR-ABL210基因陰性，經(jīng)單融合FISH探針證實(shí)骨髓59%細(xì)胞BCR-ABL融合基因陽(yáng)性。接受格列衛(wèi)治療，2006.9.7復(fù)查，F(xiàn)ISH陽(yáng)性細(xì)胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的復(fù)查結(jié)果FISH都為陰性。一、診斷其他常用于診斷的探針還有：PML/RARA，AML1/ETO，CBFβ，TEL/AML1等。以CBFβ探針為例：發(fā)生16號(hào)染色體倒位的細(xì)胞其熒光信號(hào)由2F變成1F/1R/1G。有研究表明CBFβ探針對(duì)inv(16)導(dǎo)致的CBFβ-MYH11融合基因的檢出率與分子生物學(xué)的方法相當(dāng)。一、診斷一、診斷—急性淋巴細(xì)胞白血病急性淋巴細(xì)胞白血病檢測(cè)探針探針定位異常染色體GLP4/GLP10GLP4:4p11.1-q11.1GLP10:10p11.1-q11.1+4，+10GLP17GLP17:17q11+17GLPTEL/GLPAML1GLPAML1：21q22GLPTEL：12p13

t(12;21)GLPMLLGLPMLL：11q23t(11;v)GLPBCR/GLPABL(DF)GLPBCR:22q11.2GLPABL:9q34t(9;22)鑒別診斷，以BCR/ABL探針為例：額外信號(hào)的BCR/ABL探針（ES）根據(jù)熒光信號(hào)的模式不同，可以鑒別MBCR斷裂點(diǎn)（P210）和mBCR斷裂點(diǎn)(P190)。MBCR斷裂點(diǎn)的細(xì)胞呈現(xiàn)1Y/2R/1G的信號(hào)模式，而mBCR斷裂點(diǎn)的細(xì)胞則是2Y/1R/1G的信號(hào)模式。一、鑒別診斷一、鑒別診斷雙色雙融合信號(hào)探針（DF）—雖不能區(qū)分MBCR和mBCR，但能檢測(cè)der（9）的部分序列缺失。ABL和BCR基因同時(shí)缺失：1R/1G/1YABL基因單獨(dú)缺失：1R/2G/1Y。ES探針卻無(wú)法檢測(cè)der（9）的部分序列缺失，其信號(hào)均顯示1R/1G/1Y。一、鑒別診斷IgH-CCND1男性，54歲患者，左頜下腫塊2月余白細(xì)胞增高（21.3×109/L）骨髓涂片見到增生活躍，以成熟淋巴細(xì)胞增生為主，考慮慢性淋巴細(xì)胞白血病。流式分析顯示CD5+CD19+細(xì)胞占86.5%，以CD19+的細(xì)胞群設(shè)門，CD23+細(xì)胞約占16.3%。FISH檢測(cè)患者外周血，約50%的圓形細(xì)胞顯示融合信號(hào)，提示套細(xì)胞淋巴瘤可能性大。病理證實(shí)了左頜下淋巴結(jié)非霍奇金套細(xì)胞淋巴瘤。。FISH共檢出了23例異常（76.7%）。完成核型分析的18例中僅2例檢出異常。正常核型的9例中，F(xiàn)ISH檢出7例異常。未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出5例異常。而且這些由FISH檢出的異?？寺”壤径荚?0%以上。CEP12P53D13S25RB1ATM核型陽(yáng)性例數(shù)11213121異常2正常9未見7未做12二、治療和預(yù)后分層MM中的應(yīng)用MM的骨髓瘤細(xì)胞有絲分裂指數(shù)低，且由于骨髓浸潤(rùn)程度不同，常規(guī)核型分析異常檢出率相對(duì)較低，檢出的異常往往是超二倍體和/或復(fù)雜核型。MM的遺傳學(xué)異常同樣被認(rèn)為與預(yù)后相關(guān)，13q14的缺失被認(rèn)為是復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，1q21擴(kuò)增、p53缺失也都提示預(yù)后不良。二、治療和預(yù)后分層在我院新近完成的70例MDS患者的研究中：核型和FISH分別檢出21例和22例異常，異常檢出率相當(dāng)。核型異常但FISH正常的6例，這6例異常均發(fā)生于探針覆蓋范圍以外區(qū)域。核型正常而FISH異常7例，這7例的異?？寺〖?xì)胞比例大多較低（<10%）。對(duì)于未見分裂像和正常核型的患者有一定的應(yīng)用價(jià)值，能提高小克隆異常的檢出率。二、治療和預(yù)后分層三、監(jiān)測(cè)療效

對(duì)于某些不具有特定分子水平改變，或者是基因重排方式比較特殊，常規(guī)的分子生物學(xué)方法不能檢測(cè)，但其在疾病初發(fā)時(shí)有較大片段的易位、缺失、擴(kuò)增或重排并能被現(xiàn)有的FISH探針檢出的患者，可在治療后進(jìn)行FISH監(jiān)測(cè)。FISH在異性別異基因造血干細(xì)胞移植后供受者嵌合比例的監(jiān)測(cè)中也有非常重要的價(jià)值。比較未分選細(xì)胞的STR和FISH兩種技術(shù)，F(xiàn)ISH的敏感性和準(zhǔn)確度更高，對(duì)于早期提示復(fù)發(fā)或排斥反應(yīng)的臨床應(yīng)用價(jià)值更大。四、識(shí)別移植后骨髓細(xì)胞來(lái)源小結(jié)FISH的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便迅速。雜交和檢測(cè)效率高。敏感性和特異性高，能對(duì)間期細(xì)胞進(jìn)行分析。缺點(diǎn)包括：價(jià)格