《細(xì)胞工程》第4章3：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程4課件

細(xì)胞工程CellEngineeringChapter4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程

4．1概述4．2生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞系4．3培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境4．4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝4．5動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大與優(yōu)化4．6動(dòng)物細(xì)胞代謝工程4．7動(dòng)物細(xì)胞工程產(chǎn)品制備及質(zhì)控4．8動(dòng)物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品的應(yīng)用4．5動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程的

放大與優(yōu)化

4．5．1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的研究4．5．2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化A、影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)鍵參數(shù)，營養(yǎng)物耗盡；B、決定細(xì)胞濃度有毒廢物的積累

的關(guān)鍵參數(shù)培養(yǎng)物理?xiàng)l件的惡化提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平C、細(xì)胞培養(yǎng)工藝細(xì)胞新陳代謝的控制優(yōu)化策略流加工藝的優(yōu)化4．5．3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的放大A、生物反應(yīng)器尺寸放大鼓泡B、氧氣的傳輸提高氧氣傳遞的其它方法攪拌速率和攪拌器的設(shè)計(jì)C、混合剪切力和細(xì)胞損傷D、工業(yè)生產(chǎn)中的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)4．6動(dòng)物細(xì)胞代謝工程4．6．1概述

A、生命的代謝活動(dòng)是通過活細(xì)胞和細(xì)胞群的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的，后者由一系列酶催化的級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)以及特異性的膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)所構(gòu)成。然后，活細(xì)胞這種自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)相對(duì)實(shí)際應(yīng)用而言，其遺傳特性并非最佳，需要對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾；B、代謝控制發(fā)酵（metaboliccontrolfermentetion）——是指利用遺傳學(xué)或生物化學(xué)方法，人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝，使目的產(chǎn)物大量的生成、積累的發(fā)酵；C、在代謝控制發(fā)酵的理論基礎(chǔ)上，提出和形成了“代謝工程”概念；4．6．2基本原理A、代謝網(wǎng)絡(luò)理論細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)由上萬種酶催化的系列反應(yīng)系統(tǒng)、膜傳遞系統(tǒng)、信號(hào)傳遞系統(tǒng)組成，并且既受精密調(diào)節(jié)，又互相協(xié)調(diào)；代謝網(wǎng)絡(luò)分泌處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)。根據(jù)可變程度節(jié)點(diǎn)可分：柔性節(jié)點(diǎn)、剛性節(jié)點(diǎn)和半柔性節(jié)點(diǎn)；柔性和半柔性節(jié)點(diǎn)是代謝工程設(shè)計(jì)的主要對(duì)象，節(jié)點(diǎn)剛性程度在改選前要進(jìn)行分析判斷；生物合成相關(guān)代謝調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)理論代謝工程代謝流及節(jié)點(diǎn)分析理論涉及碳源、呼吸系統(tǒng)和氧化還原重新設(shè)計(jì)主要內(nèi)容中心代謝產(chǎn)物作用機(jī)制及相關(guān)代謝分析B、代謝流及中間產(chǎn)物分析——靜態(tài)分析C、代謝控制分析——?jiǎng)討B(tài)分析B、酶合成及酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制末端代謝產(chǎn)物阻遏酶的阻遏酶合成的分解代謝物阻遏和酶的誘導(dǎo)酶的誘導(dǎo)與合成變構(gòu)酶活性的調(diào)節(jié)同工多功能酶

4．6．4代謝工程的研究方法A、設(shè)計(jì)思路改變代謝流擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑常規(guī)方法——分子生物、生化、物化代謝通量分析（MFA）—靜態(tài)B、研究代謝控制分析（MCA）—?jiǎng)討B(tài)

方法代謝網(wǎng)絡(luò)生化系統(tǒng)理論（BST）—最優(yōu)化原理

定量分析控制論模型（CM）—非線性途徑分析——途徑定位細(xì)胞代謝模型C、代謝模型的

發(fā)展與優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算生物學(xué)方法遺傳算法

D、逆代謝工程

4．7．2動(dòng)物細(xì)胞工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制

PAGE

純度SDS

液相色譜

A、物化指標(biāo)測(cè)定含量

B、安全性評(píng)介分子量

C、穩(wěn)定性

4．8動(dòng)物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品的應(yīng)用

4．8．1重組蛋白藥物

A、組織型纖溶酶原活化劑（t-PA）突變體

Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治療，人t-PA基因位于8號(hào)染色體p12-q11.2，全長36594bp，14個(gè)外顯子，13個(gè)內(nèi)含子，

t-PA由527個(gè)氨基酸，單鏈糖蛋白，開始酵母表達(dá)，不能分離純化

t-PA突變體，由雙鏈糖蛋白，現(xiàn)用CHO細(xì)胞高效表達(dá)成功（參見下圖）

B、β-干擾素（IFN-β）

最早，為一種在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，普遍存在于個(gè)體脾、肝、腎、淋巴細(xì)胞、骨髓，被多因素誘發(fā)，現(xiàn)為一組多功能細(xì)胞因子，具有抗病毒、腫瘤活性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，控制細(xì)胞生長與分化，

C、新型紅細(xì)胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量過低疾病4．8．3基因工程與亞單位疫苗

A、乙肝疫苗（參見下圖）

衣殼——衣殼表面抗原（HBsAg），核心抗原

——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸

第一代疫苗，血中提取，弱反應(yīng)，10%不產(chǎn)生反應(yīng)，

81-82年，美法，85年，中國第二代疫苗，在哺乳細(xì)胞或CHO細(xì)胞表達(dá)，81年，法美，91、92年，中國第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO細(xì)胞表達(dá)

B、艾滋病疫苗（參見下圖）

CHO表達(dá)疫苗——理論上，有致瘤性昆蟲細(xì)胞表達(dá)疫苗——昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（安全性好，容量大，表達(dá)效率高）

C、腫瘤疫苗

滅活自體腫瘤細(xì)胞

對(duì)細(xì)胞因子基因修飾，主動(dòng)加強(qiáng)疫苗免疫原性

免疫同種異體的腫瘤細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞（抗原提呈細(xì)胞）體內(nèi)外誘導(dǎo)CTL生成（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）激發(fā)特異性抗腫瘤免疫功能（注射用曲妥珠單抗，原產(chǎn)地英文商品名:赫賽?。?/p>

（Zevalin澤娃靈是世界上第一個(gè)放射性標(biāo)記的單克隆抗體，2002年在美國上市，被批準(zhǔn)用于難治復(fù)發(fā)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的治療。）

4．8．4基因治療產(chǎn)品

基因治療（genetherapy）——是指把外界的正?；蚧蛑委熁蛲ㄟ^載體轉(zhuǎn)入特定靶細(xì)胞，以最終預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)的治療方法。基因的轉(zhuǎn)移可通過物理或化學(xué)的方法，也可通過各種病毒或非病毒載體的介導(dǎo)，還可通過改造細(xì)胞（造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）進(jìn)行細(xì)胞治療。

A、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因或細(xì)胞治療：

B、造血干細(xì)胞治療癌癥HSC基因（參見下圖）

胰島素依賴型（I）C、細(xì)胞、基因代謝治療糖尿病紊亂