原位雜交實驗問題收集

胚胎原位雜交技術(shù)1通過分析mRNA在不同發(fā)育時期組織中的表達變化，有助于了解胚胎發(fā)育的基因調(diào)控機制。原位雜交是研究胚胎基因表達的常用方法，在發(fā)育生物學(xué)研究中起重要作用。胚胎原位雜交包括全胚胎原位雜交和胚胎組織切片原位雜交。全胚胎原位雜交技術(shù)(wholemountinsituhybridization)可以從整體水平反映胚胎發(fā)育過程中基因表達的時空順序，是一種廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育調(diào)控基因表達研究的技術(shù)。該技術(shù)實驗步驟少，簡單易行，大量減少了分析所需時間。全胚胎原位雜交成功的關(guān)鍵因素是進行適當?shù)牡鞍酌窴處理。使用不同探針時，應(yīng)摸索不同的蛋白酶K濃度、處理時間和溫度。全胚胎原位雜交實驗中。經(jīng)常會出現(xiàn)背景信號太強或信噪比太低的情況。產(chǎn)生這些情況的原因，通常是由于探針或抗體滯留于胚胎體腔和體室以及雜交后漂洗的條件不夠嚴格等。雜交預(yù)處理前，將胚胎在解剖鏡下用細針在腦室、頸背部、頜面部和心室等處刺孔，以使反應(yīng)后的探針或抗體不在這些部位滯留。并在漂洗時充分洗除。同時。雜交后使用RNA酶充分消化未雜交的標記RNA探針，提高雜交后漂洗的嚴格度，抗體反應(yīng)后充分漂洗均能降低背景信號，提高信噪比。對較大的胚胎標本來講，探針很難穿透整個組織．因此需切成切片后進行雜交即胚胎組織切片原位雜交，以克服全胚胎原位雜交方法中探針不能滲入到胚胎深部的問題。原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。核酸原位雜交可根據(jù)其檢測物而分為細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)其所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過組織細胞的固定，預(yù)雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。我們在這兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交，而是對完整的斑馬魚胚胎進行探針雜交及檢測，從整體上把握探針的結(jié)合部位，然后對胚胎進行切片，以確定探針結(jié)合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚分子生物學(xué)研究中是一種非常重要的實驗方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來檢測；也可以是非同位素的探針，通過熒光或酶法予以檢測。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過后者，以地高辛標記探針，然后用酶聯(lián)抗體的方法進行檢測。問題集錦1小木蟲提問：我做的是RNA原位雜交的，用的24hpf的魚，做了2次，最后顯色的時候發(fā)現(xiàn)胚胎都碎了，求助各位高人這是由哪些原因引起的，有點糾結(jié)啊，謝謝大家指點啊。蛋白酶消化時間短一點，濃度放低點試試 我用的蛋白酶濃度是10ug/ml,處理了3分鐘不知道有沒有問題2我做斑馬魚的原位雜交opcr能夠拉出基因，但是設(shè)探針以后卻怎么也不能雜交顯出信號。我自己分析有三方面的原因，一是探針合成不好，但是我重新合成的探針還是不能雜交出信號。而且我以前合成的探針能夠雜交出信號。二是表達豐度不夠，不能夠被原位雜交探測到，卻因為per的靈敏度高而檢測到。三是實驗技術(shù)和試劑不行，但是我用myod探針平行實驗?zāi)軌螂s交出信號?；卮?看到你說的第二個原因，可以確定你雜交的是他們的mRNA吧。。。有可能是表達豐度的原因，你可以先做個qPCR,看下基因和對照基因的表達量。。如果確定是表達量低的話，可以加大探針量試試。?；蛘吣闳フ艺矣袥]有做過你這個基因的PAPER，問問作者有沒有類似問題回答2在合成探針后，你跑個PCR，確定一下合成的mRNA是不是你要的，同時根據(jù)亮度估算下濃度，這樣可以估算自己要加多少量的探針。你好，你現(xiàn)在的斑馬魚原位雜交做的怎么樣了，我也做了好長一段時間，可是老是沒有結(jié)果，現(xiàn)在都想放棄了！想向你請教，能加Q聯(lián)系嗎：9069402謝謝！3原位雜交的樣品采集后需要用什么試劑出來一下，放到-80度中保存呢。原位雜交要注意什么呢？⑴保護試劑浸泡一下，采樣時取成薄方片，便于切片⑵1?樣品固定：通常用FAA,或4%多聚甲醛，4度過夜（勿超16h）2.系列乙醇脫水、透明、置換、滲透、石蠟包埋。-20度保存（可達1年）注意所有操作、試劑避免RNase污染。（不過我們的固定喲暗示用4%PFA的時候最好是不要4度過夜一般是4-5小時，4%多聚甲醛固定時間過長一般會殘留醛基在組織中，對下一步實驗造成很大的影響并且多聚甲醛固定時間過長組織變脆不利于包埋和切片）4下面三幅圖分別是文獻上的結(jié)果和我自己的實驗結(jié)果，想要的體節(jié)上那種點狀表達一直沒有做出來！各位高人，求教如下問題：提問題之前，我先告訴高人，我的探針是從Exiqon公司買來的LNAprobe，也就是特異性強的鎖定核酸探針，抗體是羅氏的，顯色試劑用過羅氏的，也用過博士德的，蛋白酶K也是羅氏的?、倥c文獻相似，我也做出來了眼睛前方鼻嗅上皮區(qū)的染色，可是文獻中體節(jié)上所出現(xiàn)的點狀

顯色，我一次也沒有做出來過？請問原因何在？？②無數(shù)次實驗中，只有兩次我做出來很快顯藍的情況，后來每次再做要不是一點也不顯色,要不就是呈現(xiàn)棕黃色（見最后一幅圖）！請問原因何在？文獻結(jié)果：個人結(jié)果

奇怪的棕色顯色回答⑴感覺樓主的背景色很深??？我沒有做過，推測能否延長雜交后的漂洗時間，降低信噪比（背景色），突出你的結(jié)果⑵你已經(jīng)成功過，說明你所說的探針和試劑是沒問題的，沒有染出來很有可能是胚胎固定出現(xiàn)了差錯，建議重新配置固定液（就是經(jīng)常用的4%PFAinPBS，我們都是有人配一大堆一起用，所以具體的我也不清楚，加熱溶解，味道挺大，分裝使用，不能反復(fù)凍融使用，4度搖床固定不要時間太久，12hpf左右就可以了），重新固定胚胎（一個月內(nèi)）一般我固定不會超過24h⑶反義探針對照，控制系統(tǒng)（探針對應(yīng)的序列和文獻中是否相同？如不同，有時會有不同的結(jié)果）⑷我做過小鼠胚胎的WISH，根據(jù)樓主提供的圖片，提出以下幾點討論：由于體節(jié)部位較深，探針要透過表皮及肌肉等組織到達體節(jié)較到達體表組織更困難，因此我覺得應(yīng)該從這方面考慮問題原因。1.樣本的取樣時間，斑馬魚年齡越小組織越薄，越容易顯影；但是也要綜合考慮目的基因的表達時間段。2.蛋白酶K的效力及消化時間，建議新鮮配制，摸索多個消化時間。相信樓主已摸索多次了，多注意細節(jié)。3.雜交液是否是買的成品？魚精蛋白？自己配制的效果不好。4.棕色顯色可能提示消化時間不夠。繼續(xù)關(guān)注！ 但是經(jīng)過這么多次的摸索感覺不太像消化不到位的原因！上面三幅圖，都是同一個miRNA的表達情況，第一幅是文獻上的結(jié)果，第二幅是我自己做出來的結(jié)果，第三幅也是（最原始的，未經(jīng)去除背景處理，處理過后和第二幅的情況一樣，與文獻結(jié)果相似，都在斑馬魚嗅覺上有較明顯的表達，但體表的神經(jīng)丘卻幾乎沒有什么表達！同樣都是72h的胚胎?。┻€有就是PK不可能每次新鮮配制吧，總共才25mg，如何準確稱重都是個嚴重的問題啊，所以我配的stocksolution,按O.lmg/mL放到4度，用的時候取點稀釋到工作濃度（10ug/mL）!雜交液是自己配的：按照文獻和探針公司提供的protocol來配的：5XSSC,50%甲酰胺，0.1%Tween-20，50mg/mLheparin,500mg/mLyeasttRNA,citricacid（460mlof1Mcitricacidsolutionfor50mlofHM）toadjustthePHto6.（0加了相應(yīng)量的citricacidsolution后從來沒有測過Ph值，因為擔(dān)心Ph計有酶），加DEPC水至50mL總之先謝謝最近文獻上看到要用新鮮的4%PFA，這個關(guān)系是不是很大，感覺似乎影響較大！是不？？結(jié)果出來向你匯報！今天來看突然想起，我要的那種點狀表達就是在體表的表達，而不是內(nèi)部的表達，所以不敢過度消化 做WISH非常費時費力，幾天下來往往沒有結(jié)果，有同感。強烈建議樓主買現(xiàn)成的雜交液，至于哪個廠家我忘了，肯定是有的。⑸我是做斑馬魚研究的。從胚胎時期看應(yīng)該在48小時了（樓主回答是72小時的），通透性很不好了，就是說蛋白酶K的消化時間一定要夠，才能保證胚胎的通透性足夠，探針進得去，沒結(jié)合的探針出得來。后面幾幅出現(xiàn)棕色染色或者表面很深染色的原因就是通透不夠，探針會掛在表面，洗不掉最終造成的飛特異染色。前面幾幅圖的原因也是這個。希望能有用。 這是72h的幼魚！之前摸索過PK的消化時間，72h的幼魚我摸索了25min,30min,35min,40min,時間過長了組織結(jié)構(gòu)就不好了！如果是這樣，我再摸索下消化時間！最近文獻上看到要用新鮮的4%PFA，這個關(guān)系是不是很大，感覺似乎影響較大！是不？？⑹不知道你之后做的結(jié)果如何。對于你的問題，其實原位雜交的結(jié)果由于一些基因本身的原因，比如表達量比較低，探針的特異性或者存在一些不可知的調(diào)控，甚至有不同的選擇性剪切本，做出來的結(jié)果不同實驗室或者不同時間做出來的都會有一些出入。你的結(jié)果和別人的出入，你可以再仔細看看取樣的時間，以及所選探針的片段，看和別人所做的有沒有區(qū)別；還有就是顯色時間，如果過長，體節(jié)上比較弱的表達可能會顯色出來。你也可以降低雜交溫度試一試。也有可能你的探針比較特異，而別人的比較差。顯色棕黃的問題，我也碰到過，不過之后用酒精一脫水，就會變深藍，不會影響最終結(jié)果。 文獻上用的5?和3?雙標的Exiqon探針，我沒有錢，所以用的是5?單標的探針！這頂多會比別人染色差一點，也不至于一點染色也沒有！關(guān)于棕色染色的問題，我以前做的時候，兩三個小時就開始染出了藍色，可是后來再也做不出這樣的結(jié)果了！后來我也照文獻終止染色后用甲醇梯度脫水后，發(fā)現(xiàn)去掉了不少背景，而且也變成了藍色！總感覺這實驗不是這樣做的！ 不要常溫顯色過夜，如果這樣，肯定是全黑。你可以嘗試4度過夜看看。如果實在不行，你就問文獻的作者要他們的探針。 拿甲醇去除背景后是下面的情況:⑺你的顯色應(yīng)該是過度了顏色太深了；建議開始顯色時每15分鐘或者10分鐘觀察一次。我做過斑馬魚的整體原位雜交，從48h到7天的都做過，我個人覺得這個實驗很重要的一部就是蛋白酶消化，但是你的基因是在體表表達，消化時間應(yīng)該掌握很短，還有只要探針沒問題，其他的步驟只要按照protocol來基本上是沒問題的！ 探針應(yīng)該沒有問題，之前就用這些探針做出來過，只是現(xiàn)在再也做不出來了，太奇怪了！做出來那次是染色的時候可能也就2個小時就顯藍了，而現(xiàn)在怎么都不顯色，常溫過夜后，到處都是，背景很深，用甲醇洗過后才可以看部分特異的染色！而我現(xiàn)在根本找不到那兩次能做出來的原因，更不用說做不出來的原因了！考慮過了，首先應(yīng)該不是探針的問題，其次消化的問題應(yīng)該也不會太大，因為是在體表表達的東西，穿透應(yīng)該很簡單吧！現(xiàn)在唯一能想到的就是雜交的溫度問題，可是我的溫度與之前做出來那次溫度沒有差別啊！還有會不會是PFA的問題，文獻都說要用新鮮的PFA固定組織，這個關(guān)系是不是很大？ ⑻我們實驗室的protocol是顯色完全后用75%的乙醇脫色，請教樓主，跟甲醇脫色有什么區(qū)別嗎？那種的效果好啊？用甲醇脫色一般是多久？也需要過半小時或