離心技術與細胞器分離

離心技術與細胞器分離第1頁/共23頁離心技術與細胞器的分離第2頁/共23頁一

實驗目的1、以分離葉綠體、細胞核為例,掌握離心機的操作技術及兩種不同的離心方法：差速離心法、密度梯度離心法;

2、光鏡鑒定各種細胞器的提取情況及了解葉綠體、細胞核的形態(tài)。第3頁/共23頁二實驗原理離心技術（centrifugaltechnique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時都會受到一個向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術。離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）第4頁/共23頁離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運動時受到的一個向外的力。離心力（Fc）的大小取決于角速度與旋轉半徑，即：

Fc=mω2r其中ω是旋轉角速度，以弧度/秒為單位；r是顆粒離開旋轉中心的距離，以cm為單位；m是質量，以g為單位。第5頁/共23頁相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）

又稱相對離心加速度，是指離心力相當于重力加速度的倍數(shù)。在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示。RCF=(mω2r)/(mg)=1.119×10-5n2r式中r為離心轉子的半徑距離，指離心管的重心至轉軸中心間的距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉子每分鐘的轉數(shù)（rpm）。第6頁/共23頁離心力的轉換列線圖

第7頁/共23頁離心機制備性分析性分析性超速離心機普通離心機冰凍離心機臺式（或地面式）普通離心機大容量冰凍離心機小于0.6萬轉/分高速冰凍離心機0.6-2.5萬超速冰凍離心機2.5-8萬或更高

概述臺式高、超速離心機0.6-10萬轉/分以上

離心機的基本分類第8頁/共23頁離心機的結構

離心機的主要部件為轉頭、主軸、電動機和傳動裝置、制動器、外殼和機座。第9頁/共23頁離心機的轉頭主要有：角度轉頭（angle-headedrotors）、甩平式水平轉頭（swing-outrotors）/吊桶式轉頭（swingingbucketrotors）

水平轉頭

角度轉頭第10頁/共23頁離心技術類型

常用離心技術一般包括：差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）密度梯度離心法(densitygradientcentrifugation)。第11頁/共23頁差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時間下分批分離的方法，稱為差速離心法。常用于從組織勻漿中分離各種細胞器。第12頁/共23頁Figure8-9MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Thepreparativeultracentrifuge第13頁/共23頁差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）第14頁/共23頁密度梯度離心原理：當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，在密度梯度介質中，顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏细∑?，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時間，它們再也不移動了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質得到分離。等密度梯度離心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介質。此法一般應用于物質的大小相近，而密度差異較大時。常用來分離提取核酸、亞細胞器和質粒。第15頁/共23頁Densitygradientcentrifugation

第16頁/共23頁Densitygradientcentrifugation

第17頁/共23頁第18頁/共23頁實驗步驟1．將材料用蒸餾水洗凈。用濾紙吸干水后,去葉脈,稱取2克葉片,用剪刀剪碎后放入研缽。2．量取10ml勻漿buffer，先向研缽中倒入5ml后開始研磨。3．四層紗布過濾，收集過濾液到10ml離心管中，再將剩下的5ml勻漿buffer沖洗研缽后也過濾到管中，5000rpm離心5分鐘,去上清。4．加入0.5%TritonX-1002.5ml,混勻，振蕩后靜置3分鐘.5000rpm離心5分鐘，去上清。5．加入1mlCSKbuffer振蕩混勻,可以用槍頭輕輕吹打沉淀使其溶解.第19頁/共23頁6．濾膜過濾（300目）,去掉未裂解的原生質體及裂解的細胞膜內溶物等大塊雜質，收集過濾液。

以上步驟所提到的細胞核不純,其中混雜有原生質體、線粒體、葉綠體,下面采用蔗糖密度梯度離心分離細胞核和葉綠體。7.把含有2.3M蔗糖的CSKbuffer3ml加至于離心管底部.8.再把3ml60%percollCSKbuffer輕輕的平鋪于7的溶液上方,用移液槍加時一定要小心順著管壁把一溶液平鋪于另一溶液之上.這時應該能觀察到溶液明顯的分層現(xiàn)象.9.然后把6中過濾溶液輕輕的平鋪于8的溶液上方。觀察分層現(xiàn)象。10.3200g離心32分鐘，溶液梯度層重新分布。11.分別吸取一些各層的溶液進行改良品紅苯酚染色、鏡檢。觀察不同大小不同密度的細胞器的分布情況以及他們的形態(tài)特征。

第20頁/共23頁試劑

勻漿buffer：5mMMES,6.8mMCaCl2,11mMKH2PO4,0.3M山梨醇,0.3M甘露醇,0.4％PVP-30．

CSKbuffer:100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsucrose.

60%percollCSKbuffer

：60%percoll,100mMKCl,3mMMgCl2,1mMEGTA(PH8.0),10mMPIPES(PH6.8),300mMsucrose.

2.3M