雙脫氧末端終止測(cè)序法原理過(guò)程和目標(biāo)基因cDNA序列拼接

雙脫氧末端終止法測(cè)序的原理、過(guò)程和目標(biāo)基因序列的分析教師：程琳2011年11月分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1第一頁(yè)，共四十七頁(yè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解雙脫氧鏈終止法的基本原理，掌握DNA測(cè)序的基本方法；2、學(xué)會(huì)序列查詢(xún)、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜索和比對(duì)。2第二頁(yè)，共四十七頁(yè)。

DNA測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。A.

雙脫氧鏈終止法（thechainterminationmethod），是通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。B.

化學(xué)降解法（chemicaldegradationmethod），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序。一、DNA測(cè)序的方法3第三頁(yè)，共四十七頁(yè)。1.Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，是由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。4第四頁(yè)，共四十七頁(yè)?；驹恚壕郾０纺z電泳可以區(qū)分長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’-末端。因?yàn)閐dNTP3’不是-OH，不能與下一個(gè)核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長(zhǎng)。5第五頁(yè)，共四十七頁(yè)。6第六頁(yè)，共四十七頁(yè)。2、具體操作：測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng),每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸（稱(chēng)為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中,ddATP會(huì)隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H,所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。7第七頁(yè)，共四十七頁(yè)。同理第二個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的;第三個(gè)反應(yīng)的都以G結(jié)尾,第四個(gè)反應(yīng)的都以T結(jié)尾,電泳后就可以讀出序列了.8第八頁(yè)，共四十七頁(yè)。假如有一個(gè)DNA,互補(bǔ)序列是GATCCGAT,我們?cè)囍鲆幌?在第一個(gè)反應(yīng)中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三個(gè)堿基時(shí)沒(méi)什么問(wèn)題,但遇到A時(shí),摻入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一個(gè)如果參與反應(yīng)的是ddATP則終止,產(chǎn)生一個(gè)僅有2個(gè)核苷酸的序列:GA,否則繼續(xù)延伸,可以產(chǎn)生序列GATCCG,又到了下一個(gè)A了.同樣有兩種情況,如果是ddATP摻入,則產(chǎn)生的序列是GATCCGA,延伸終止,否則可以繼續(xù)延伸,產(chǎn)生GATCCGAT.將得到如下結(jié)果：1產(chǎn)生的都是以A結(jié)尾的片段:GA,GATCCGA。234產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的片段:GATC,GATCC產(chǎn)生的都是以G結(jié)尾的片段:G,GATCCG

產(chǎn)生的都是以T結(jié)尾的片段:GAT,GATCCGAT9第九頁(yè)，共四十七頁(yè)。制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。

即可得到測(cè)序結(jié)果：為GATCCGAT10第十頁(yè)，共四十七頁(yè)。制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

3、技術(shù)路線：11第十一頁(yè)，共四十七頁(yè)。4、高通量自動(dòng)化測(cè)序DNA序列分析自動(dòng)化包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一方面是指“分析反應(yīng)”的自動(dòng)化，另一方面是指“讀片過(guò)程”的自動(dòng)化。自動(dòng)化的DNA序列分析，也是根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的基本原理發(fā)展起來(lái)的。12第十二頁(yè)，共四十七頁(yè)。自動(dòng)化測(cè)序原理自動(dòng)化測(cè)序類(lèi)似于PCR反應(yīng)，但只用一條引物，反應(yīng)混合物中含有不同熒光標(biāo)記的ddNTP與4種dNTP。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過(guò)檢測(cè)儀時(shí)給出特定信號(hào)，由計(jì)算機(jī)判讀并記錄。優(yōu)點(diǎn)：可用雙鏈DNA做模板；模板用量少，不必克??；可實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化。13第十三頁(yè)，共四十七頁(yè)。高速自動(dòng)DNA測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，通過(guò)精密的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測(cè)區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過(guò)檢測(cè)孔的DNA片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出具特異性波長(zhǎng)的熒光。這些熒光通過(guò)聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長(zhǎng)區(qū)別開(kāi)來(lái)。經(jīng)成像透像最后由高靈敏度的相機(jī)分段收集信號(hào)，傳送給計(jì)算所分析處理。14第十四頁(yè)，共四十七頁(yè)。熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號(hào)，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過(guò)熒光監(jiān)測(cè)儀時(shí)，可由光信號(hào)讀出末端核苷酸并由電腦記錄。15第十五頁(yè)，共四十七頁(yè)。16第十六頁(yè)，共四十七頁(yè)。Sanger雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的測(cè)序能力：

手工測(cè)序：最大約300bp；

自動(dòng)測(cè)序：最大約1200bp。17第十七頁(yè)，共四十七頁(yè)。二、序列比對(duì)分析1.相似性與同源性相似性(similarity)：是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說(shuō)，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。這是個(gè)量化的關(guān)系。當(dāng)然可進(jìn)行自身局部比較。18第十八頁(yè)，共四十七頁(yè)。同源性(homology)：指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個(gè)基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判斷。就是說(shuō)A和B的關(guān)系上，只有是同源序列，或者非同源序列兩種關(guān)系。而說(shuō)A和B的同源性為80％都是不科學(xué)的。19第十九頁(yè)，共四十七頁(yè)。序列的相似性和序列的同源性有一定的關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)序列間的相似性越高的話(huà)，它們是同源序列的可能性就更高，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^(guò)序列的相似性來(lái)推測(cè)序列是否同源。正因?yàn)榇嬖谶@樣的關(guān)系，很多時(shí)候?qū)π蛄械南嗨菩院屯葱跃蜎](méi)有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等價(jià)混用兩個(gè)名詞。所以有出現(xiàn)A序列和B序列的同源性為80％一說(shuō)。20第二十頁(yè)，共四十七頁(yè)。序列相似性比較：

就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫(kù)進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；21第二十一頁(yè)，共四十七頁(yè)。序列同源性分析：

是將待研究序列加入到一組與之同源，但來(lái)自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有CLUSTAL等；22第二十二頁(yè)，共四十七頁(yè)。2.Blast簡(jiǎn)介及應(yīng)用（1）Blast簡(jiǎn)介BLAST是由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）開(kāi)發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序。BLAST是“局部相似性基本查詢(xún)工具”（BasicLocalAlignmentSearchTool）的縮寫(xiě)。23第二十三頁(yè)，共四十七頁(yè)。Blast是一個(gè)序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多個(gè)獨(dú)立的程序，這些程序是根據(jù)查詢(xún)的對(duì)象和數(shù)據(jù)庫(kù)的不同來(lái)定義的。比如說(shuō)查詢(xún)的序列為核酸，查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)亦為核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，那么就應(yīng)該選擇blastn程序。

下表列出了主要的blast程序：24第二十四頁(yè)，共四十七頁(yè)。主要的blast程序程序名查詢(xún)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列Blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進(jìn)行比對(duì)。25第二十五頁(yè)，共四十七頁(yè)。（2）Blast資源26第二十六頁(yè)，共四十七頁(yè)。Blast結(jié)果會(huì)列出跟查詢(xún)序列相似性比較高，符合限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一些信息：1.查詢(xún)序列可能具有某種功能；2.查詢(xún)序列可能是來(lái)源于某個(gè)物種；3.查詢(xún)序列可能是某種功能基因的同源基因；…這些信息都可以應(yīng)用到后續(xù)分析中。27第二十七頁(yè)，共四十七頁(yè)。（3）Blast應(yīng)用登陸n(yōu)cbi的blast主頁(yè)核酸序列蛋白序列翻譯序列底下有其他一些針對(duì)特殊數(shù)據(jù)庫(kù)的和查看以往的比對(duì)結(jié)果等28第二十八頁(yè)，共四十七頁(yè)。Blast任務(wù)提交表單11.序列信息部分填入查詢(xún)（query）的序列序列范圍（默認(rèn)全部）選擇搜索數(shù)據(jù)庫(kù)如果接受其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊開(kāi)始搜索29第二十九頁(yè)，共四十七頁(yè)。Blast任務(wù)提交表單2設(shè)置搜索的范圍，entrez關(guān)鍵詞，或者選擇特定物種2.設(shè)置各種參數(shù)部分一些過(guò)濾選項(xiàng)，包括簡(jiǎn)單重復(fù)序列，人類(lèi)基因組中的重復(fù)序列E值上限窗口大小如果你對(duì)blast的命令行選項(xiàng)熟悉的話(huà)，可以在這里加入更多的參數(shù)30第三十頁(yè)，共四十七頁(yè)。Blast任務(wù)提交表單33.設(shè)置結(jié)果輸出顯示格式選擇需要顯示的選項(xiàng)以及顯示的文件格式顯示數(shù)目Alignment的顯示方式篩選結(jié)果E值范圍其他一些顯示格式參數(shù)點(diǎn)擊開(kāi)始搜索31第三十一頁(yè)，共四十七頁(yè)。提交任務(wù)返回查詢(xún)號(hào)（requestid）可以修改顯示結(jié)果格式修改完顯示格式后點(diǎn)擊進(jìn)入結(jié)果界面32第三十二頁(yè)，共四十七頁(yè)。結(jié)果頁(yè)面1圖形示意結(jié)果33第三十三頁(yè)，共四十七頁(yè)。結(jié)果頁(yè)面2目標(biāo)序列描述部分帶有g(shù)enbank的鏈接，點(diǎn)擊可以進(jìn)入相應(yīng)的genbank序列匹配情況，分值，e值34第三十四頁(yè)，共四十七頁(yè)。結(jié)果頁(yè)面3詳細(xì)的比對(duì)上的序列的排列情況35第三十五頁(yè)，共四十七頁(yè)。（4）一個(gè)例子假設(shè)以下為一未知蛋白序列>query_seqMSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA

我們通過(guò)blast搜索來(lái)獲取一些這個(gè)序列的信息。36第三十六頁(yè)，共四十七頁(yè)。具體步驟：37第三十七頁(yè)，共四十七頁(yè)。1.登陸n(yōu)cbi的blast主頁(yè)2.選擇程序，因?yàn)椴樵?xún)序列是蛋白序列可以選擇blastp，點(diǎn)擊進(jìn)入也可以選擇tblastn作為演示，我們這里選blastp38第三十八頁(yè)，共四十七頁(yè)。3.填入序列（copy＋paste）Fasta格式，或者純序列4.選擇搜索區(qū)域，這里我們要搜索整個(gè)序列，不填5.選擇搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，這里我們選nr(非冗余的蛋白序列庫(kù))。是否搜索保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)（cdd），蛋白序列搜索才有。我們選上39第三十九頁(yè)，共四十七