chap基因操作常規(guī)技術

第四章基因工程的常規(guī)技術?分離檢測?分子雜交?PCR技術

?DNA測序

?基因定點突變

?DNA與Pr互作現(xiàn)在是1頁\一共有120頁\編輯于星期日4.1核酸的分離與檢測gDNA的分離質粒DNARNA的分離現(xiàn)在是2頁\一共有120頁\編輯于星期日細胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法現(xiàn)在是3頁\一共有120頁\編輯于星期日CTAB法高鹽:溶解低鹽:沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70%alc現(xiàn)在是4頁\一共有120頁\編輯于星期日如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內(nèi)源DNase＞pH7現(xiàn)在是5頁\一共有120頁\編輯于星期日4.1.2質粒DNA的分離純化拓撲學的差異gDNA大,易解旋質粒小,ccc狀態(tài)現(xiàn)在是6頁\一共有120頁\編輯于星期日proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴散浮力密度差樣品+EB樣品BD=該位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及離心時間現(xiàn)在是7頁\一共有120頁\編輯于星期日SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.堿變性法pH12:變性程度pH7:復性速度離心:收集?現(xiàn)在是8頁\一共有120頁\編輯于星期日3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s離心Eth沉淀

現(xiàn)在是9頁\一共有120頁\編輯于星期日4.1.3RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍現(xiàn)在是10頁\一共有120頁\編輯于星期日防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺器皿、手套、口罩低溫操作現(xiàn)在是11頁\一共有120頁\編輯于星期日4.1.4核酸質量檢測紫外光譜法凝膠電泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀釋[dsDNA]=50(A260A310)

稀釋[ssRNA]=40(A260A310)

稀釋熒光分析法二苯胺顯色現(xiàn)在是12頁\一共有120頁\編輯于星期日分子篩;電荷效應UV→EB→熒光凝膠電泳技術現(xiàn)在是13頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是14頁\一共有120頁\編輯于星期日凝膠成像系統(tǒng)現(xiàn)在是15頁\一共有120頁\編輯于星期日Rf、分辨力的影響因素大小,構型gel濃度電壓、時間buffer凝膠濃度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12現(xiàn)在是16頁\一共有120頁\編輯于星期日緩沖液及其pHTBE:緩沖力大?長:TAE﹥TBE?短:TAE分辨力低如何防止pH和離子強度改變?現(xiàn)在是17頁\一共有120頁\編輯于星期日RNA的檢測A260變性膠28S→4.5kb18S→2.1kb現(xiàn)在是18頁\一共有120頁\編輯于星期日PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或熒光標記測序、多態(tài)性分析現(xiàn)在是19頁\一共有120頁\編輯于星期日＞40kb:Rf與分子大小無關交替改變的電場,線團→束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+B現(xiàn)在是20頁\一共有120頁\編輯于星期日B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖現(xiàn)在是21頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是22頁\一共有120頁\編輯于星期日A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋轉膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+現(xiàn)在是23頁\一共有120頁\編輯于星期日影響分辨率的因素脈沖時間(0.1s-1000s):長脈沖,大片段電壓:場強↑,最大片段范圍↑電場夾角:110–120溫度:4℃

現(xiàn)在是24頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2分子雜交技術SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位雜交現(xiàn)在是25頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2.1

探針與探針標記寡核苷酸片段ssords足夠長度不含互補區(qū)現(xiàn)在是26頁\一共有120頁\編輯于星期日5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探針的標記現(xiàn)在是27頁\一共有120頁\編輯于星期日隨機引物標記現(xiàn)在是28頁\一共有120頁\編輯于星期日5末端標記5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

現(xiàn)在是29頁\一共有120頁\編輯于星期日2.

標記物及其檢測標記物及性質標記方法雜交體檢測法地高辛:DIGRPL酶標抗體-底物顯色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶標親合素顯色熒光素:羅丹明,FITC合成法熒光顯微鏡放射性標記非放射性現(xiàn)在是30頁\一共有120頁\編輯于星期日地高辛系統(tǒng)標記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯(lián)復合物現(xiàn)在是31頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是32頁\一共有120頁\編輯于星期日生物素標記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin

Avidin

烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物現(xiàn)在是33頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是34頁\一共有120頁\編輯于星期日熒光素標記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin

Avidin烷烴連接臂現(xiàn)在是35頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是36頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2.2

Southern雜交質粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?現(xiàn)在是37頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是38頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2.3Northern雜交樣品,電泳,探針?不宜堿變性?勿低鹽buffer洗膜?膠中無EB現(xiàn)在是39頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2.4Western雜交電泳,印跡,免疫學主要步驟SDS,blot雜交(AP或HRP)現(xiàn)在是40頁\一共有120頁\編輯于星期日Semi-drytransfersystem現(xiàn)在是41頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是42頁\一共有120頁\編輯于星期日斑點雜交4.2.5現(xiàn)在是43頁\一共有120頁\編輯于星期日Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).現(xiàn)在是44頁\一共有120頁\編輯于星期日制片探針制備雜交鏡檢、拍照4.2.6

FISH雜交現(xiàn)在是45頁\一共有120頁\編輯于星期日基因檢測新技術使膀胱癌確診提前“FISH技術在膀胱癌檢測中的臨床應用研究”,為期2年,對4809例患者開展了臨床檢測實驗.結果:比臨床常規(guī)檢查,膀胱癌確診提前36m雜交探針和檢測試劑已實現(xiàn)國產(chǎn)化,質量穩(wěn)定可靠,價格比進口產(chǎn)品降低近七成現(xiàn)在是46頁\一共有120頁\編輯于星期日4.2.7菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測菌落→?文庫菌斑→?文庫現(xiàn)在是47頁\一共有120頁\編輯于星期日4.3PCR擴增技術鏈式反應動物單拷貝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

現(xiàn)在是48頁\一共有120頁\編輯于星期日4.3.1基本原理離體合成幾何級數(shù)平臺效應現(xiàn)在是49頁\一共有120頁\編輯于星期日4.3.2反應體系模板引物Taq酶dNTPs緩沖液DNAormRNA模板純度數(shù)量現(xiàn)在是50頁\一共有120頁\編輯于星期日引物的設計1630nt,GC含量連續(xù)互補堿基﹤3

3?正確配對5?可被修飾簡并引物現(xiàn)在是51頁\一共有120頁\編輯于星期日耐熱的DNApolTaq酶Pfu酶?3→5校讀?高保真現(xiàn)在是52頁\一共有120頁\編輯于星期日緩沖液pH、離子強度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特異↑引物退火現(xiàn)在是53頁\一共有120頁\編輯于星期日4.3.2基本過程變性退火延伸現(xiàn)在是54頁\一共有120頁\編輯于星期日擴增精確性的影響因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart現(xiàn)在是55頁\一共有120頁\編輯于星期日4.3.3PCR技術的改進nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR實時定量PCR現(xiàn)在是56頁\一共有120頁\編輯于星期日1.巢式PCR嵌套引物外引物內(nèi)引物現(xiàn)在是57頁\一共有120頁\編輯于星期日2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化環(huán)化再酶切擴增現(xiàn)在是58頁\一共有120頁\編輯于星期日反向PCR的特點難選適當?shù)南拗泼笖U增的長度有限自身環(huán)化效率低現(xiàn)在是59頁\一共有120頁\編輯于星期日3.AnchoredPCR?錨定引物A?擴增?產(chǎn)物鑒定現(xiàn)在是60頁\一共有120頁\編輯于星期日特點擴增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高現(xiàn)在是61頁\一共有120頁\編輯于星期日4.RT-PCR現(xiàn)在是62頁\一共有120頁\編輯于星期日5.原位PCR原位擴增,雜交,定量?不需抽提模板?靈敏度高100?病毒檢測、腫瘤發(fā)生率現(xiàn)在是63頁\一共有120頁\編輯于星期日通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測,實現(xiàn)對起始模板定量分析的方法6.實時熒光定量PCR現(xiàn)在是64頁\一共有120頁\編輯于星期日FRET技術;熒光標記探針擴增、雜交、光譜、實時檢測熒光信號積累,起始模板量熒光定量PCR的原理現(xiàn)在是65頁\一共有120頁\編輯于星期日起點定量與終點定量起點天然重現(xiàn)性好終點加工誤差大現(xiàn)在是66頁\一共有120頁\編輯于星期日熒光擴增曲線的三個階段背景信號階段指數(shù)擴增平臺期現(xiàn)在是67頁\一共有120頁\編輯于星期日幾個參數(shù)的確定①臨界點②循環(huán)數(shù)(Ct)③標準曲線基線→閾值→Ct值→DNA0閾值缺省:3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍現(xiàn)在是68頁\一共有120頁\編輯于星期日Log濃度與循環(huán)數(shù)的關系起始數(shù)越多,Ct值越小標準曲線→樣品Ct值→初始模板量現(xiàn)在是69頁\一共有120頁\編輯于星期日DNA產(chǎn)物的熒光標記非特異性熒光標記SYBRGreenI特異性熒光標記TaqMan探針分子信標現(xiàn)在是70頁\一共有120頁\編輯于星期日①SYBRGreen法只有和dsDNA結合后才發(fā)熒光變性時,DNA雙鏈分開,無熒光現(xiàn)在是71頁\一共有120頁\編輯于星期日延伸結束階段采集熒光信號與非特異的dsDNA結合發(fā)光,必須在反應結束時做融解曲線分析現(xiàn)在是72頁\一共有120頁\編輯于星期日SYBRGreen融解曲線分析現(xiàn)在是73頁\一共有120頁\編輯于星期日PCR反應體系的建立及優(yōu)化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號太弱,不易檢測引物:擴增有雜帶,定量不準Mg2+:1.5mM,減少非特異性產(chǎn)物T&T:由酶和引物決定現(xiàn)在是74頁\一共有120頁\編輯于星期日SYBRGreen法優(yōu)缺點對模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結合,產(chǎn)生假陽性對引物特異性要求較高現(xiàn)在是75頁\一共有120頁\編輯于星期日5-R;3熒光淬滅基團(Q)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q吸收,無熒光;R與Q分開,發(fā)熒光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法現(xiàn)在是76頁\一共有120頁\編輯于星期日TaqMan水解型雜交探針原理當一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時,供體熒光分子自身的熒光強度衰減,FRET現(xiàn)在是77頁\一共有120頁\編輯于星期日熒光共振能量轉移現(xiàn)在是78頁\一共有120頁\編輯于星期日擴增1條DNA→釋放1個熒光分子→熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物同步現(xiàn)在是79頁\一共有120頁\編輯于星期日TaqMan法PCR反應的建立PP的設計:探針Tm為70℃,<30bp,5’非G;引物Tm為60℃反應參數(shù):

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循環(huán)PP優(yōu)化:獲得最小Ct值,最大信號/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM現(xiàn)在是80頁\一共有120頁\編輯于星期日TaqMan法優(yōu)缺點對目標序列的高特異性引物設計相對簡單重復性比較好只適合一個特定的目標委托公司標記,價格較高現(xiàn)在是81頁\一共有120頁\編輯于星期日③分子信標與擴增產(chǎn)物結合產(chǎn)生熒光,信號的強弱→靶序列的多少現(xiàn)在是82頁\一共有120頁\編輯于星期日發(fā)夾型熒光探針R與Q接近,產(chǎn)生FRET探針-模板配對,構象改變R與Q分離→熒光現(xiàn)在是83頁\一共有120頁\編輯于星期日熒光定量PCR的特點實時檢測特異性強定量精確無需跑膠現(xiàn)在是84頁\一共有120頁\編輯于星期日4.4DNA測序化學降解法末端終止法現(xiàn)在是85頁\一共有120頁\編輯于星期日G反應:DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G斷裂T+C:肼使嘧啶環(huán)斷開,哌啶除去堿基C反應:高鹽下,僅C與肼反應,C末端

1.Maxam-Gilbert化學降解法現(xiàn)在是86頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是87頁\一共有120頁\編輯于星期日距標記末端250nt非酶促合成測序,無需引物對合成的寡核苷酸測序蛋白質與DNA的相互作用特點現(xiàn)在是88頁\一共有120頁\編輯于星期日2.Sanger酶學法現(xiàn)在是89頁\一共有120頁\編輯于星期日基本步驟模板純化測序反應模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4個反應→4組產(chǎn)物PAGE→自顯影→X光片上樣電泳放射自顯影現(xiàn)在是90頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是91頁\一共有120頁\編輯于星期日測序與PCR的比較測序PCR引物1條1對合成線性指數(shù)底物dNTP和dddNTP產(chǎn)物系列長度片段1條帶現(xiàn)在是92頁\一共有120頁\編輯于星期日CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自動測序同位素標記熒光標記?單色熒光?多色熒光現(xiàn)在是93頁\一共有120頁\編輯于星期日時間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖現(xiàn)在是94頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是95頁\一共有120頁\編輯于星期日多色熒光標記templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA現(xiàn)在是96頁\一共有120頁\編輯于星期日ABIPrism3100-Avant現(xiàn)在是97頁\一共有120頁\編輯于星期日遺傳分析儀的多種應用現(xiàn)在是98頁\一共有120頁\編輯于星期日基本步驟模板的純化與定量測序反應—PCR儀產(chǎn)物的純化與變性上樣電泳—測序儀結果分析現(xiàn)在是99頁\一共有120頁\編輯于星期日AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.現(xiàn)在是100頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是101頁\一共有120頁\編輯于星期日4.DNA測序技術進展現(xiàn)在是102頁\一共有120頁\編輯于星期日傳統(tǒng)測序技術的缺陷及新進展序列不可能太長費時費力準確度不高結構復雜序列雜交法質譜法DNA芯片法單分子法現(xiàn)在是103頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是104頁\一共有120頁\編輯于星期日4.5DNA的定點誘變盒式取代切除;合成;轉化olig介導PCR誘變現(xiàn)在是105頁\一共有120頁\編輯于星期日olig片段退火合成轉化olig介導的誘變現(xiàn)在是106頁\一共有120頁\編輯于星期日OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule現(xiàn)在是107頁\一共有120頁\編輯于星期日P

C

R

誘變現(xiàn)在是108頁\一共有120頁\編輯于星期日現(xiàn)在是109頁\一共有120頁\編輯于星期日4.6

DNA與蛋白質互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting現(xiàn)在是110頁\一共有120頁\編輯于星期日1.酵母雙雜交(Y2H)GAL4proteinBD與UAS結合AD激活lacZ單獨不起作用GAL1UAS啟動子lacZreporter現(xiàn)在是111頁\一共有