FDA藥物相互作用研究指南

介紹內(nèi)容簡介藥物相互作用研究的背景知識藥物相互作用研究的一般策略體內(nèi)藥物相互作用的實驗設計藥物代謝酶的確認CYP酶抑制/誘導作用的體外評價P-gp底物和抑制劑的體外實驗研究現(xiàn)在是1頁\一共有45頁\編輯于星期日簡介美國FDA藥物評價和研究中心(CDER)生物制品評價和研究中心(CBER)2006年9月共同發(fā)布藥物相互作用研究-實驗設計、數(shù)據(jù)分析及其在劑量調(diào)整和處方標簽中的應用的指南現(xiàn)在是2頁\一共有45頁\編輯于星期日簡介指南為新藥和新生物制品的研發(fā)者提供了：藥物代謝藥物轉(zhuǎn)運體內(nèi)體外相互作用研究規(guī)范現(xiàn)在是3頁\一共有45頁\編輯于星期日簡介內(nèi)容涉及藥物相互作用研究的全過程包括：實驗設計研究人群或體外研究用細胞、微粒體探針底物、抑制劑、誘導劑的選擇觀察指標、樣本量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，等除了代謝性藥物相互作用以外，還對P糖蛋白介導的藥物相互作用的研究方法給予了詳細的指導（與1999年版本相比的增加內(nèi)容）現(xiàn)在是4頁\一共有45頁\編輯于星期日1.藥物相互作用研究的背景知識包括細胞色素P450(CYP)酶在內(nèi)的多個藥物代謝酶都能被聯(lián)用的藥物所抑制/誘導藥物濃度發(fā)生巨大改變影響藥物安全性和有效性現(xiàn)在是5頁\一共有45頁\編輯于星期日同時,藥物轉(zhuǎn)運蛋白相關的藥物相互作用受到越來越多的關注如:P-gp、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（OAT），等。表一：人類主要的轉(zhuǎn)運蛋白和已知的底物、抑制劑、誘導劑現(xiàn)在是6頁\一共有45頁\編輯于星期日現(xiàn)在是7頁\一共有45頁\編輯于星期日2.藥物相互研究的一般策略根據(jù)體外代謝、已知和誘導實驗的結果及體內(nèi)代謝實驗數(shù)據(jù)確定體內(nèi)相互作用研究必要性。流程圖現(xiàn)在是8頁\一共有45頁\編輯于星期日現(xiàn)在是9頁\一共有45頁\編輯于星期日目前尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6酶被誘導的情況，而CYP2C,CYP2B和P-gp是可以和CYP3A一起被誘導的。CYP3A對所有已知的誘導劑都很敏感。因此，考察受試藥物能否能夠誘導CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19和CYP3A時，只需要體外考察對CYP1A2和CYP3A酶的誘導情況即可。若體外實驗顯示受試藥物對CYP3A無誘導作用，那么就可以免做對CYP2C和CYP2B的誘導研究?，F(xiàn)在是10頁\一共有45頁\編輯于星期日3.體內(nèi)藥物相互作用實驗設計實驗設計研究群體底物和作用藥物的選擇給藥途徑給藥劑量現(xiàn)在是11頁\一共有45頁\編輯于星期日3.1實驗設計思路：比較底物（S）濃度在有和沒有作用藥物（I）時的變化情況。隨機交叉法（先服用S后服用S+I組、先服用S+I組后服用S組）單次序交叉法（總是先服用S后服用S+I組、或相反）平行設計（一組服用S,一組服用S+I）現(xiàn)在是12頁\一共有45頁\編輯于星期日設計方案時應該注意：(1)如果實驗需要達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度而底物或作用藥物和(或)其代謝物的半衰期較長,此時不能采用額外給予一個負荷劑量的方法加快達到穩(wěn)態(tài)。(2)如果作用藥物是一個快速可逆的抑制劑,其服用時間應該在測定當天服用底物前或同時服用,這樣才能增加其敏感性。對于基于作用機制的抑制劑(如紅霉素),在服用底物藥物前服用作用藥物可以放大相互作用強度。如果作用藥物(抑制劑或誘導劑)的吸收受多種因素的影響(如胃pH值),則需要采取適當?shù)姆椒刂莆辗矫娴淖兓?3)為了排除由于食物、飲料、果汁等影響代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白而引起誤差,指南建議實驗過程中要嚴格控制飲食?，F(xiàn)在是13頁\一共有45頁\編輯于星期日3.2研究群體一般是健康受試者。在特定環(huán)境下，受試藥物表現(xiàn)的治療效果或者藥效學效果不在健康者身上出現(xiàn)，此時要從患者群體中招募受試者。藥物相互作用的程度可能因受試者某個具體CYP酶的基因型不同而有所差異?，F(xiàn)在是14頁\一共有45頁\編輯于星期日3.3底物和作用藥物的選擇表二：指南推薦的CYP酶底物?，F(xiàn)在是15頁\一共有45頁\編輯于星期日現(xiàn)在是16頁\一共有45頁\編輯于星期日“雞尾酒”模式釋義：在一個實驗中受試者同時服用多種CYP酶底物。實驗設計需考慮下列因素：(1)一種特定酶的底物對該酶具有較高的選擇性;(2)底物之間沒有相互作用發(fā)生;(3)受試者的數(shù)量達到統(tǒng)計學要求。(4)藥物濃度變化在安全范圍內(nèi);(5)入選的CYP酶都參與藥物代謝消除;(6)藥物其他代謝途徑或者不被抑制的途徑的藥物清除率低。現(xiàn)在是17頁\一共有45頁\編輯于星期日評價：這種雞尾酒實驗的陰性結果可以免除對其中某個具體酶的進一步評價,然而陽性結果則需要進一步的體內(nèi)研究。雞尾酒實驗可比單個相互作用研究提供更多的信息,而結論的確定程度取決于藥物其他不被抑制的代謝途徑的清除率分數(shù)(清除率分數(shù)越小,確定程度越高)。如果單一的相互作用實驗顯示抑制效應可以導致嚴重的安全隱患,則不能進行雞尾酒設計法?，F(xiàn)在是18頁\一共有45頁\編輯于星期日3.4給藥途徑受試藥物的給藥途徑應與將來臨床應用的方式一致。體內(nèi)相互作用研究采取的給藥方式取決于未來上市劑型?，F(xiàn)在是19頁\一共有45頁\編輯于星期日3.5給藥劑量實驗設計應盡可能將底物和作用藥物相互作用的結果最大化，因此指南推薦作用藥物（抑制劑/誘導劑）使用最大安全劑量和最短給藥間隔。當使用低于臨床常用劑量的給藥方案時，體內(nèi)藥物相互作用研究方案應在結果報告中進行討論?，F(xiàn)在是20頁\一共有45頁\編輯于星期日4.藥物代謝酶的確認如果某個酶對藥物的代謝量占整個藥物消除量>25%,則可以確認此酶是藥物的主要代謝酶。將藥物和肝細胞或肝切片一起孵育,然后通過色譜方法分析孵育介質(zhì)和細胞內(nèi)藥物濃度,這種方法可以直接獲得氧化、水解或基團轉(zhuǎn)移形成的代謝物,提供平行代謝還是先后代謝的信息。另一種方法是用HPLC來分析孵育介質(zhì)。實驗還需要優(yōu)化介質(zhì)中受試藥物濃度和孵育時間。臨床預期的穩(wěn)態(tài)血藥濃度可以用來指導體外實驗介質(zhì)中藥物濃度的選擇?，F(xiàn)在是21頁\一共有45頁\編輯于星期日有三種方法可以很好地確認不同的CYP酶對藥物代謝的貢獻:(1)特定的化學物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑

表5：列出了常用的特異性化學抑制劑。在確定代謝酶種類及其在藥物代謝中的相對貢獻時,藥物的濃度要≤Km值,而抑制劑的濃度既要保證其選擇性又要保證足夠的量,所以可以采用一系列的抑制劑濃度。當使用基于作用機制的抑制劑時,最好將抑制劑與酶預先孵育15～30min。現(xiàn)在是22頁\一共有45頁\編輯于星期日現(xiàn)在是23頁\一共有45頁\編輯于星期日(2)應用不同的人重組CYP酶,這種技術對研究單個CYP酶在整個藥物代謝中的相對貢獻的大小具有很高的價值,但不能代表人肝微粒體酶中的絕對的代謝比率。(3)根據(jù)不同供體來源的CYP酶不同活性建立人肝微粒體庫。指南建議至少采用上述兩種方法來確認藥物代謝酶現(xiàn)在是24頁\一共有45頁\編輯于星期日5.CYP酶抑制作用的體外評價Review:Ki：抑制率常數(shù)，抑制作用越強，此值越小IC50

：反應被抑制一半時抑制劑的濃度，越低表明抑制劑的抑制能力越強。現(xiàn)在是25頁\一共有45頁\編輯于星期日5.CYP酶抑制作用的體外評價CYP酶抑制劑體外實驗設計注意事項:(1)IC50測定時,在底物代謝率允許的情況下,盡量使底物的濃度低于其Km值,使IC50與其Ki值更具相關性;(2)肝微粒體蛋白濃度通常<1g·L-1;(3)緩沖液的性質(zhì)、pH對Vmax和Km的影響顯著,盡可能采用標準化的分析條件;(4)反應系統(tǒng)中最好控制底物或抑制劑的消耗不超過10%～30%,但是對于Km值很低的藥物來說,控制反應體系底物消耗<10%很困難;現(xiàn)在是26頁\一共有45頁\編輯于星期日(5)建議建立時間-產(chǎn)物形成量的線性關系;(6)建議建立酶量-產(chǎn)物形成量的線性關系;(7)因為某些有機溶劑具有酶誘導或抑制作用,溶劑的濃度都要<1%(v/v),最好<0.1%,實驗應包括無溶劑對照和溶劑對照;(8)實驗應該有一個已知抑制劑的陽性對照?，F(xiàn)在是27頁\一共有45頁\編輯于星期日相互作用程度的模擬：R=1+[I]/Ki（[I]代表作用部位抑制劑的濃度,Ki是抑制常數(shù)）指南推薦體內(nèi)相互作用的可能性通過[I]/Ki來推斷,[I]代表服用臨床最大用藥量后平均穩(wěn)態(tài)的藥物濃度(游離或結合的全部藥物),比值升高,產(chǎn)生相互作用的可能性增大?，F(xiàn)在是28頁\一共有45頁\編輯于星期日盡管通過體外數(shù)據(jù)定量預測體內(nèi)相互作用發(fā)生的可能性存在困難,但可以通過同一個藥物對不同CYP酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、CYP2D6和CYP3A)的Ki值進行篩選排序,體內(nèi)實驗從[I]/Ki

最大者(或者Ki最小者)的CYP酶開始,如果實驗顯示體內(nèi)不存在藥物相互作用,其他的[I]/Ki相對較小的CYP酶的體內(nèi)實驗就可以不做。現(xiàn)在是29頁\一共有45頁\編輯于星期日6.CYP酶誘導作用的體外評價實驗設計中應包括一個公認的酶誘導劑作為陽性對照,來減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。表7:誘導劑選擇列表現(xiàn)在是30頁\一共有45頁\編輯于星期日現(xiàn)在是31頁\一共有45頁\編輯于星期日實驗中應注意：(1)受試藥物的濃度應該參考臨床治療劑量的血藥濃度,至少包括3個涵蓋治療窗的篩選濃度,其中至少1個濃度要超過平均預期治療濃度1個數(shù)量級;(2)與肝細胞共孵育2～3d后,通過CYP特異的探針藥物(參考指南推薦)測定酶活性;(3)使用新鮮分離的或者凍存的肝細胞進行實驗時,應該至少選擇3份不同的供體以減少誘導實驗中存在的個體差異?，F(xiàn)在是32頁\一共有45頁\編輯于星期日評價藥物酶誘導作用時,指南建議:(1)藥物體外實驗引起的酶活性的改變≥40%陽性對照結果時,可以認為藥物具有酶誘導作用,需要進一步的體內(nèi)研究;(2)EC50可以用來比較不同誘導劑誘導能力的強弱;(3)指南認為,根據(jù)目前了解的CYP酶誘導的細胞學機制,如果一個誘導實驗顯示對CYP3A4酶沒有誘導作用,可以推斷此藥物對CYP2C8,CYP2C9和CYP2C19也沒有誘導作用?，F(xiàn)在是33頁\一共有45頁\編輯于星期日7.P-gp底物和抑制劑的體外實驗研究考察藥物是否是P-gp的底物或抑制劑,最常見的方法有哪些？現(xiàn)在是34頁\一共有45頁\編輯于星期日雙向轉(zhuǎn)運測定法由于更直接,因此被作為標準的方法。ATP酶活性測定法和攝取/外排法可以用于快速篩選,但是不能區(qū)分是底物還是抑制劑。如果藥物透過性(膜擴散能力)低,ATP酶法和熒光定量法常常無法識別是否是P-gp的底物。對高通透性化合物,雙向轉(zhuǎn)運測定法也不適用?，F(xiàn)在是35頁\一共有45頁\編輯于星期日這些底物作為陽性對照，保證實驗用細胞能夠表達功能性的P-gp.現(xiàn)在是36頁\一共有45頁\編輯于星期日7.1雙向轉(zhuǎn)運實驗確定藥物是否是P-gp的底物選擇好細胞系和P-gp底物陽性對照后,遵循下列步驟完成實驗:(1)設計幾個不同的藥物濃度(如1,10,100μmol·L-1)考察P-gp對藥物的外排作用;(2)實驗開始前,將極性細胞組成的膜兩側(cè)的介質(zhì)去掉,加入新的介質(zhì)并孵育30min;(3)進行雙向膜轉(zhuǎn)運通透性研究:在極性膜的A側(cè)(apical側(cè),腔側(cè),頂區(qū)側(cè),轉(zhuǎn)運方向是A→B)或B側(cè)(basolateral側(cè),基底側(cè),轉(zhuǎn)運方向是B→A)加入適量體積的含有已知P-gp底物或受試藥物的緩沖液;(4)在37°C孵育,在預定的時間(通常是1,2,3,4h)收集受側(cè)的介質(zhì)測定藥物濃度,同時迅速補充緩沖液;現(xiàn)在是37頁\一共有45頁\編輯于星期日(5)已知P-gp底物作為陽性對照進行同樣的實驗;(6)當采用LLC2PK1-MDR1MDCK-MDR1作為實驗細胞系時,相應的野生型細胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對照;(7)每個實驗至少在不同日期重復3次,考察日間和日內(nèi)變異情況;(8)理想的實驗還應該測定底物的回收率,來消藥物代謝和非特異性結合帶來的誤差現(xiàn)在是38頁\一共有45頁\編輯于星期日由于Caco-2、野生型的LLC-PK1和MDCK也能表達其他外排轉(zhuǎn)運蛋白,因此在評價藥物是否是P-gp底物時要謹慎,為增加實驗的可信性,建議增加P-gp抑制劑(表10)存在下的底物驗證實驗,如果藥物的外排可被P-gp抑制劑明顯抑制,則說明藥物的外排與P-gp有關。指南還建議,可以通過實驗對比MDR1過度表達細胞(轉(zhuǎn)染型細胞)和它們的野生型細胞對藥物外排活性的差異,確定P-gp在藥物外排中的貢獻大小?，F(xiàn)在是39頁\一共有45頁\編輯于星期日利用下列公式描述藥物跨膜表觀通透性:Papp=(Vr/c0)(1/S)(dc/dt)其中,Vr是極性膜受側(cè)介質(zhì)體積,c0是指膜供側(cè)實驗藥物的濃度,S是指極性細胞形成的膜的面積,dc/dt是受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時間曲線的斜率。準確計算Papp必須要求受側(cè)藥物濃度與時間是直線關系。藥物經(jīng)P-gp外排速率RE可以通過下列公式計算:RE=PB/A/PA/BPB/A和PA/B分別代表受試藥物B→A和A→B的跨膜表觀通透性?，F(xiàn)在是40頁\一共有45頁\編輯于星期日7.2雙向轉(zhuǎn)運實驗確定藥物是否是P-gp抑制劑(1)使用Caco-2細胞系時,要使用無藥介質(zhì)作為空白對照,測試藥物的濃度要適宜;(2)當采用LLC-PK1-MDR1和MDCK-MDR1作為實驗細胞系時,相應的野生型細胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對照;(3)37℃孵育細胞系0.5～1h后,去除孵育介質(zhì),換成濃度合適的P-gp探針底物(表9);(4)孵育細胞系1～3h后,測定受側(cè)介質(zhì)中P-gp探針底物的濃度;(5)每個實驗至少在不同日期重復3次,每個實驗也要用至少3個極性細胞膜進行測定?，F(xiàn)在是41頁\一共有45頁\編輯于星期日7.