基因工程復(fù)習(xí)

A而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)分子技術(shù)(從細(xì)菌到高等生物)。DNA(2)適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；(3)外源基因的導(dǎo)入；(4)外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測(cè)與轉(zhuǎn)基因生物的篩選；(5)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的核實(shí)；列(外顯子)的轉(zhuǎn)錄RNA被剪接在一起時(shí)，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個(gè)轉(zhuǎn)錄物中除去。NA個(gè)字母相同，則II的特征：識(shí)別序列主要為4-6bp,或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列。但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列,切割位置因酶而異,有些是隔開(kāi)的。識(shí)別回文對(duì)稱結(jié)大腸桿菌DNA聚合酶cDNARNaseHDNARNA的mRNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，RNA分子；依賴于DNAT4DNA連接酶的活性：可修復(fù)雙鏈DNA上的單鏈缺口；連接RNA-DNADNA鏈缺口或RNA鏈缺口；連接完全斷開(kāi)的兩個(gè)平頭末端DNA分子。堿性磷酸酶的活性：⑴在用32P標(biāo)記DNA5′端之前，去除5′端的磷酸；⑵DNA，提高重組子比例。DNA(cccDNA)，這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；稱之為開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)。若質(zhì)粒DNA的雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線形分子，則通稱為L(zhǎng)構(gòu)型。段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。組子為Apr、lacZ-基因型，乳白色菌落；而非重組子則為Apr、lacZ+基因型的藍(lán)色菌落。(2)具有多種限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，且切點(diǎn)是單一的，這樣可將多個(gè)外源DNA片段插入其(4)載體DNA的分子量適當(dāng)，可容納較大的外源DNA片段，又可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多體(ColE)、抗生素抗性標(biāo)記基因(ampr)、cos位點(diǎn)，可像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。黏粒大小一般為5~7kb，可克隆大片段DNA，克隆的最大片段可達(dá)45kb。酵母染色體的端粒序列、酵母染色體的復(fù)制子、酵母染色體的著絲粒序列、酵母系統(tǒng)的選kb對(duì)模板DNA的識(shí)別部位和結(jié)合部位，是轉(zhuǎn)錄過(guò)程能否起始的決定部位，其本身不轉(zhuǎn)錄。一mRNAmRNA翻譯的起始效率主要由其序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)。啟動(dòng)子lac及其衍生啟動(dòng)子tac都是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在IPTG的誘導(dǎo)下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。T7噬菌體啟動(dòng)子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別，大腸桿菌的RNA聚合酶無(wú)法識(shí)別。將T7RNA聚合酶基因(T7gene1)置于lacUV5啟動(dòng)子之后，構(gòu)建噬菌體，再將此噬菌體大腸桿菌BL21(DE3)；將pET表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌后，因再引入一個(gè)帶有粒，如pLysS或pLysE，它們表達(dá)的T7溶菌酶可抑制在未添加IPTG時(shí)T7啟動(dòng)子激活。T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)TRNA聚合酶的活性，進(jìn)一步防止和層析分離。純化的融合蛋白再用Xa因子切割，可切除組氨酸標(biāo)簽，從而獲得目的蛋白。N，從而達(dá)到維護(hù)目的蛋白活性的目的。體。。在pH高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，質(zhì)粒NA當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚/氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。Southern雜交為DNA雜交，探針為DNA或RNA。檢測(cè)DNA。Northern雜交為RNA雜交，探針為DNA或cDNA。原理、操作與Southern相似。Western雜交為蛋白質(zhì)的免疫分析探針為抗體。Western雜交的總體過(guò)程與Southern雜交相NorthernSouthern印跡的不同點(diǎn)NAADNADNase)后，細(xì)DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜A物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。變性與退火→延伸→變性與退火→延伸(重復(fù))PCR體系各成分的作用。離子，用于激活DNA酶的活性中心，一般使用Mg2+，有時(shí)使用Mn2+。dNTP：dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。引物：在多數(shù)試驗(yàn)中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各1mM，即1pmol/ml。濃度過(guò)高易導(dǎo)也正是高溫DNA聚合酶的應(yīng)用才使得PCR技術(shù)得以推廣。Taq酶與Pfu酶的異同。TthDNA聚合酶可在高溫下做RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄和引物延伸反應(yīng)，避免RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)→5'外切活性的PCR酶。TaqDNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3‘末端添加一個(gè)核苷酸，通常為A。因此，TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序的原理。的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。易錯(cuò)PCR的概念：是指通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件來(lái)調(diào)整PCR反應(yīng)中突變的頻率,降低聚合酶固有的突變序列傾向性,提高突變譜的多樣性,使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地以一定的頻率摻入到擴(kuò)重疊延伸PCR誘變的原理。對(duì)于兩個(gè)具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性后，兩個(gè)DNA片段之間通鏈，在引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落cDNAmRNA酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。N——代表一個(gè)基因組文庫(kù)所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)DNA總長(zhǎng)的比值?；蚪MDNA文庫(kù)的構(gòu)建流程、示意圖。新的表型或使宿主恢復(fù)其突變基因的遺傳的物質(zhì)或性狀,是生物個(gè)體或群體間遺傳差異的客觀表征。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳術(shù)來(lái)直接將表達(dá)調(diào)控機(jī)制有清楚的了解。②易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉。③經(jīng)內(nèi)含子，所以只能用其cDNA。②許多真核生物基因僅在大腸桿菌中工程產(chǎn)品，動(dòng)物、植物、微生物表達(dá)系統(tǒng)各舉一例，并分別說(shuō)明供體生物為人類，目的基因的產(chǎn)物的作用：只需300~600只這樣的母豬就能滿足全世界對(duì)人體蛋白fatorⅧ需求。