培養(yǎng)基的制備與滅菌3課件

實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一:培養(yǎng)基的制作與滅菌技術(shù)(3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二:血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)靈芝孢子粉數(shù)量(3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三:土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)(稀釋平板法)(3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)四:微生物的純化,培養(yǎng)與保種技術(shù)(3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)五:微生物菌落形態(tài)觀察(1學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)六:微生物大小的測(cè)定(2學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)七:革蘭氏染色(3學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的與要求：1、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握制備培養(yǎng)基的過(guò)程。2、學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌操作技術(shù)。3、了解干熱滅菌操作要點(diǎn)。

二、原理及說(shuō)明:培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基包括有水份、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類以及生長(zhǎng)素等五大類營(yíng)養(yǎng)成份。此外還得有適宜的PH值，一定的滲透壓（即濃度）以及氧化還原電位等。1、培養(yǎng)基的分類（1）根據(jù)培養(yǎng)基原料來(lái)源不同：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基（2）根據(jù)物理性狀分為：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基（3）根據(jù)培養(yǎng)基使用的用途：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的配制（1）原料稱量、溶解：按下列培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取各成分，在容器中加所需水量的一半，然后依次將各種原料加入水中，用玻棒攪拌使之溶解。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先將瓊脂稱好洗凈，然后將液體培養(yǎng)基煮沸，再把瓊脂放入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化。（2）調(diào)節(jié)PH值用精密的pH試紙測(cè)定，并用1%氧化鈉或5%鹽酸調(diào)節(jié)到所需的pH值。（3）過(guò)濾和澄清：趁熱用紗布將培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾，除去沉渣、顆粒，使之澄清透明。（4）分裝：過(guò)濾后根據(jù)不同需要，立即趁熱裝入試管或三角瓶等容器中，分裝如圖：培養(yǎng)基的分裝注意事項(xiàng)：（1）不要使培養(yǎng)基沾在管口，如沾上，需用干凈的紗布擦干凈。（2）液體培養(yǎng)基：分裝高度以試管的1/4左右為宜。（3）固體培養(yǎng)基：分裝試管，其裝量為管高的1/6~1/5滅菌后制成斜面。分裝三角瓶容量之一半為宜。（4）半固體培養(yǎng)基：分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后，垂直待凝成半固體深層瓊脂。（6）做棉塞裝好培養(yǎng)基的試管都要加上棉塞，這樣既可過(guò)濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，制棉塞的方法多種，形狀各異，總原則如下：（1）用脫脂棉制作（脫脂棉花易吸水）（2）松緊適合（3）塞頭不要太大，一般為球狀。（7）包裝試管口或三角瓶口棉塞部分，用牛皮紙?jiān)?，以防滅菌時(shí)水蒸氣打濕棉塞。（8）滅菌滅菌是指殺死物品上或環(huán)境中的所有微生物。滅菌方法可分為四種：物理滅菌、機(jī)械滅菌、化學(xué)滅菌和生物滅菌。物理滅菌：1、熱力滅菌：2、紫外光滅菌：一般應(yīng)用于無(wú)菌室和接種箱的滅菌。熱力滅菌：干熱滅菌：適用于玻璃儀器，將物品放入烘箱，160~170oC，1~2小時(shí)?；鹧鏈缇哼m用于常用用具，如接種環(huán)、鑷子等。滅菌方法是放在火焰上直接灼燒。濕熱滅菌：(1)高壓蒸汽滅菌：適用于培養(yǎng)基、衣物等的滅菌。（2）間歇蒸汽滅菌：適用于不耐高溫的培養(yǎng)基或無(wú)高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)。（3）巴斯德滅菌：適用于牛乳類等不耐高溫的物體。紫外光滅菌：一般應(yīng)用于無(wú)菌室和接種箱的滅菌。原理與區(qū)別基本原理：即通過(guò)不同的加熱方法，使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的,蛋白質(zhì)的凝固變性與蛋白質(zhì)中含水量的多少有關(guān)，含水量較多者，其凝固所需要的溫度低，反之，含水份較少者需要高溫才能使蛋白質(zhì)凝固。因此殺滅芽孢比殺滅營(yíng)養(yǎng)體所需的溫度高。干熱滅菌與濕熱滅菌的區(qū)別：在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時(shí)水蒸汽穿透力強(qiáng)，水蒸汽的導(dǎo)熱性也強(qiáng)。而且當(dāng)蒸汽與被滅菌的物體接觸凝為水時(shí)，又可放出熱量，使被滅菌物體溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌鍋是一個(gè)耐高壓又密閉的金屬鍋。它是利用在密閉條件下產(chǎn)生高壓蒸汽來(lái)達(dá)到滅菌的效果。其溫度在100oC以上，有強(qiáng)大的殺菌能力。因此它是一種用途廣泛，效率高的滅菌工具。分類：1、臥式2、立式具體操作步驟：（1）加入適量自來(lái)水于滅菌鍋中（至水位線）（2）擺入上述包裝好的待滅菌的培養(yǎng)基，注意：不要擺得太擠，以免影響蒸汽流通和滅菌效果。（3）加蓋旋緊螺旋，使蒸汽鍋密閉不漏氣（對(duì)角線均勻擰旋）（4）打開放氣閥，打開電源，自開始產(chǎn)生蒸汽后10min（此時(shí)蒸汽鍋內(nèi)的冷空氣由排氣閥排盡）關(guān)緊放氣閥，讓溫度隨蒸汽壓力上升而上升，當(dāng)達(dá)所需壓力時(shí)（15磅/平方英寸）控制熱源維持所需時(shí)間（30min）然后停止加熱，讓其自然冷卻。（5）待壓力降至0磅時(shí)，打開排氣閥，再打開鍋蓋，取出滅菌物。注意：壓力未降至0磅時(shí)，切勿打開鍋蓋，否則突然降壓，招致培養(yǎng)基沸騰，沾濕棉塞，甚至沖出管外。（6）自鍋中取出滅菌好的培養(yǎng)基，放置稍冷卻后擺成斜面，而后至37oC恒溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)，方可保存?zhèn)溆谩?yīng)用此法滅菌是否徹底的一個(gè)重要關(guān)鍵是在壓力上升之前，必須將鍋內(nèi)的冷空氣完全排盡，否則雖然壓力表已指15磅/平方英寸（1.055kg/cm2,121.6℃）時(shí)，但鍋內(nèi)的溫度還只有100oC，結(jié)果往往造成滅菌不徹底。斜面擺放示意圖：無(wú)菌水的制備：用10ml量筒量取9.0ml的自來(lái)水，裝入18*180的中號(hào)試管中，用100ml量筒量取99ml的自來(lái)水裝入250ml的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮紙包好，高壓滅菌，備用。移液管、培養(yǎng)皿的干熱滅菌：（1）在移液管尾部塞上少許脫脂棉花，然后用報(bào)紙條包好。（2）用報(bào)紙條包好干燥的培養(yǎng)皿。（3）將已包好的移液管、培養(yǎng)皿放入電烘箱干熱滅菌。干熱滅菌是在恒溫電箱中進(jìn)行，它是利用高熱空氣來(lái)達(dá)到滅菌效果，因此稱干熱滅菌。適合玻璃器皿和金屬用具的滅菌。帶有膠皮的物品，含水份的物質(zhì)，培養(yǎng)基等不可用這種方法。操作步驟：（1）將待滅菌物品包扎好，均勻放入烘箱內(nèi)，注意不要擺的太擠，以免妨礙氣流流通。（2）打開鼓風(fēng)機(jī)、開啟電源，當(dāng)溫度100oC時(shí)，關(guān)閉通氣孔，調(diào)溫度至160oC，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制調(diào)節(jié)器，保持此溫度1~2小時(shí)。（3）中斷電源，待溫度降至60oC以下時(shí)，打開箱門，取出滅菌物品。注意事項(xiàng)滅菌物品不能堆的太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升滅菌物品不能直接放在電烘箱底板上，以防報(bào)紙烘焦滅菌溫度恒定在160-170℃為宜，溫度過(guò)高，紙和棉花會(huì)被烤焦降溫時(shí)，待溫度自然降至60℃下再打開箱門取出物品，以免因溫度過(guò)高而驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。培養(yǎng)基配制步驟與配方：1、稱藥:量小不易稱量,可先配成高濃度的溶液再按比例稀釋2、溶化:不易溶解的,可先用小容器溶解,或溶于其他溶劑3、pH值:用1%NaOH或用1%HCl調(diào),當(dāng)配大量培養(yǎng)基時(shí)可用10%NaOH或用10%HCl調(diào),配制酸度高(低于pH值3-4)時(shí),應(yīng)該在凝固前將適量經(jīng)過(guò)滅菌過(guò)的酸加在培養(yǎng)基中,否則不凝固4、過(guò)濾5、分裝6、做棉塞P587、包裝8、滅菌滅菌對(duì)培養(yǎng)基的影響酸度的變化,碳水化合物的水解,葡萄糖發(fā)生的反應(yīng),沉淀的產(chǎn)生梅拉特反應(yīng):葡萄糖與氨基酸反應(yīng)而使氨基酸失效鐵離子與磷酸鹽很容易生成沉淀,常需分開滅菌實(shí)驗(yàn)完成內(nèi)容：（4人一組）1、包培養(yǎng)皿(12皿/組）。2、9ml的無(wú)菌水，6支/組。（試管）3、99ml無(wú)菌水（數(shù)粒玻璃珠），1瓶/組4、做NA斜面2根/人。5、固體培養(yǎng)基平均分裝入2個(gè)三角瓶中,裝2/3(三角瓶)。理科班高澤氏1號(hào)（1L）,文科班PDA（1L）,,另值日生NA（1L））.6、全班1ml的藍(lán)色槍頭4盒,0.2ml黃色槍頭4盒7、0.5ml的無(wú)菌水2管/人（1.5ml的離心管）。8、濕熱滅菌。9、干熱滅菌。10、40%甘油100ml。11、無(wú)菌水兩瓶。思考作業(yè)題：1、總結(jié)一下，配制培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問(wèn)題。2、高壓滅菌的關(guān)鍵是什么？3、干燥滅菌為何要比濕熱高溫蒸汽滅菌所需的溫度高，時(shí)間長(zhǎng)?4、為何配制培養(yǎng)基后要調(diào)節(jié)PH值？培養(yǎng)基配制步驟與配方：NA牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌)：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂20g水1000mlPH7.0~7.2

121oC滅菌20分鐘淀粉硝酸鉀培養(yǎng)基（高澤氏1號(hào)）淀粉20.0g、硝酸鉀1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、水1000.0ml。調(diào)節(jié)。為分離、培養(yǎng)放線菌常用的培養(yǎng)基。