園林植物遺傳育種學第八章分子育種

第八章分子育種第一頁，共五十八頁。一、分子育種的概念與程序概念

按照人們的愿望，進行嚴密的設計，通過體外DNA重組技術和DNA轉(zhuǎn)移技術，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在短時間內(nèi)趣于完善，以創(chuàng)造出新的生物類型的技術體系，亦即基因工程。第二頁，共五十八頁。2.植物基因工程植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術及植物組織培養(yǎng)技術而發(fā)展起來的現(xiàn)代生物技術。第三頁，共五十八頁。3.基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導入受體分子外源基因的表達和產(chǎn)物的分離重組子的檢測第四頁，共五十八頁。第五頁，共五十八頁。4.觀賞植物基因工程的目的基因1、觀賞性開花、花色、花型、花徑相關基因。2、抗逆性抗蟲、抗旱、耐鹽堿、抗寒相關基因3、切花壽命4、花期調(diào)控第六頁，共五十八頁。二、基本技術及原理（一）DNA重組技術將外源DNA片段與載體分子連接，形成重組DNA分子，再將重組子導入寄主細胞內(nèi)。這一技術體系稱為DNA重組技術。第七頁，共五十八頁。DNA

重

組

技

術第八頁，共五十八頁。（二）基因工程的基本概念1.轉(zhuǎn)化（Transformation)：是指將外源DNA導入受體細胞的過程。2.復制子（Replicon)：具有一個復制起點(ori)的DNA分子稱為一個復制子。3.載體（Vector）：能與外源DNA連接并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的復制子。4.重組子（Recombinant）：連接了外源DNA分子的復制子。第九頁，共五十八頁。（三）基因工程的工具酶限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease)DNA連接酶（ligase)末端修飾酶第十頁，共五十八頁。（五）基因工程的載體系統(tǒng)1、質(zhì)粒載體2、噬菌體載體3、病毒載體第十一頁，共五十八頁。第十二頁，共五十八頁。質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建啟動子外源基因終止子啟動子報告基因終止子

（標記基因）

目的片段選擇標記

載體第十三頁，共五十八頁。(六)植物基因工程的報告基因定義特點在選擇培養(yǎng)基上生長報告基因與目的基因嵌和表達研究調(diào)控區(qū)第十四頁，共五十八頁。報告基因的種類新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基因氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因β–葡萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因熒光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草劑（Basta,Bar）基因第十五頁，共五十八頁。三、轉(zhuǎn)基因操作的方法第十六頁，共五十八頁。

(一)外源DNA導入植物細胞的方法載體介導的轉(zhuǎn)化方法DNA直接導入法種質(zhì)系統(tǒng)法第十七頁，共五十八頁。外源DNA導入植物細胞的方法1、致癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法2、病毒介導的基因轉(zhuǎn)移3、基因槍介導的基因轉(zhuǎn)化4、PEG誘導的基因轉(zhuǎn)化5、脂質(zhì)體介導6、電激法介導7、超聲波介導8、顯微注射9、激光微束10、種質(zhì)系統(tǒng)介導基因轉(zhuǎn)化法第十八頁，共五十八頁。1、致癌農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法含有Ti質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物的細胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分（T-DNA）可以導入植物細胞，整和到植物基因組DNA隨其復制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的片段的DNA片段重組，導入致癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤法、原生質(zhì)體培養(yǎng)法、細胞培養(yǎng)法，通過致癌農(nóng)桿菌介導進入植物細胞。第十九頁，共五十八頁。根瘤農(nóng)桿菌及Ti質(zhì)粒第二十頁，共五十八頁。Ti質(zhì)粒根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價閉合環(huán)狀的DNA分子。第二十一頁，共五十八頁。Ti質(zhì)粒的功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；參與寄主細胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。第二十二頁，共五十八頁。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)Vir區(qū)LBRBETiPlasmidT-DNA區(qū)Ori區(qū)Con區(qū)第二十三頁，共五十八頁。Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能Vir區(qū)是一段長度為35KB操縱子包含六個基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA的結(jié)構(gòu)與功能∶LBRBLBRB第二十四頁，共五十八頁。植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢載體）雙元載體（反式載體）第二十五頁，共五十八頁。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報告基因，選擇標記基因Vir區(qū)目的基因報告基因，選擇標記基因LBRB第二十六頁，共五十八頁。農(nóng)桿菌導入方法共培養(yǎng)法葉盤轉(zhuǎn)化法整株感染法原生質(zhì)體共培養(yǎng)法第二十七頁，共五十八頁。2、基因槍介導的轉(zhuǎn)基因操作基本原理操作步驟優(yōu)點影響轉(zhuǎn)化效率的因素第二十八頁，共五十八頁。第二十九頁，共五十八頁。Bio-RadBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystem第三十頁，共五十八頁。Bio-RadBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystem第三十一頁，共五十八頁。操作步驟預培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)基因植株篩選和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定田間釋放第三十二頁，共五十八頁。影響轉(zhuǎn)化效率的因素金屬微粒DNA沉淀輔助劑DNA純度和濃度微彈速度植物材料第三十三頁，共五十八頁?；驑尫ǖ膬?yōu)點無宿主限制；靶受體類型廣泛；可控度高；操作簡便。第三十四頁，共五十八頁。問題：轉(zhuǎn)化效率低；嵌合體多；穩(wěn)定性差，瞬時表達；外源基因沉默；整合機理不詳。第三十五頁，共五十八頁。3、PEG誘導的基因轉(zhuǎn)化

聚乙二醇（PEG）、多聚鳥苷酸、磷酸鈣在高PH值條件下誘導原生質(zhì)體撲獲DNA分子。第三十六頁，共五十八頁。步驟：共保溫；稀釋PEG；非選擇培養(yǎng)；選擇培養(yǎng)。第三十七頁，共五十八頁。

優(yōu)點：轉(zhuǎn)化順利，對細胞傷害?。槐苊馇逗象w的生成；易于選擇；便于進行理論研究；受體廣泛。第三十八頁，共五十八頁。4、脂質(zhì)體介導用化學物質(zhì)將DNA包裹成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬作用，把DNA導入細胞。第三十九頁，共五十八頁。5、電激法介導

利用高壓脈沖作用，在原生質(zhì)體上形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的攝取。＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－第四十頁，共五十八頁。6、超聲波介導

7、顯微注射

8、激光微束第四十一頁，共五十八頁。9、種質(zhì)系統(tǒng)介導法生物媒體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第四十二頁，共五十八頁。(二)轉(zhuǎn)基因操作的受體系統(tǒng)1、高頻再生體系的建立愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)生殖細胞再生系統(tǒng)第四十三頁，共五十八頁。2、抗生素敏感實驗抑制細菌生長殺死非轉(zhuǎn)化細胞3、農(nóng)桿菌敏感實驗第四十四頁，共五十八頁。(三)轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植株的再生

恢復生長篩選培養(yǎng)植株再生第四十五頁，共五十八頁。四、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定遺傳鑒定表達鑒定表型分析鑒定利用報告基因Northern雜交Western雜交

直接鑒定DNA分子是否整合到基因組上。1）擴增目的片段；2）雜交信號鑒定。（Southern雜交）第四十六頁，共五十八頁。鑒定步驟：篩選鑒定（利用質(zhì)粒上的選擇標記）報告基因鑒定（利用質(zhì)粒上的報告基因）遺傳鑒定生長試驗

DNA鑒定-southernRNA鑒定-northern蛋白質(zhì)鑒定-western第四十七頁，共五十八頁。SouthernDNA印跡雜交第四十八頁，共五十八頁。植物遺傳轉(zhuǎn)化流程適宜外植體的選擇及再生體系的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇遺傳轉(zhuǎn)化操作載體介導的轉(zhuǎn)化方法DNA直接導入法種質(zhì)系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株鑒定獲得再生植株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應用利用報告基因Southern雜交Northern雜交Western雜交第四十九頁，共五十八頁。五、基因工程的安全性（一）安全問題的考慮工程菌株的處理轉(zhuǎn)基因植物的釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全第五十頁，共五十八頁。1.轉(zhuǎn)基因作物本身成為雜草；2.轉(zhuǎn)基因作物使其親緣野生種成為雜草或超級雜草；3.轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生新的病毒或疾病；4.轉(zhuǎn)基因作物對非目標生物的危險；5.轉(zhuǎn)基因作物作為外來種對新生境的入侵，使生物多樣性受到威脅；6.轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)過程的影響；7.其它一些不可預計的風險。（二）轉(zhuǎn)基因植物的風險第五十一頁，共五十八頁。（三）生物安全的管理法國為對遺傳修飾生物體(GMO)的評價和立法成立了兩個專門委員會。第一個是遺傳工程委員會，成立于1975年，任務集中于實驗室的重組DNA的研究；1986年又成立了生物分子工程委員會，它的任務是評價遺傳修飾生物體的大田試驗、釋放以及商品化過程的安全問題。第五十二頁，共五十八頁。進入90年代特別是1992年聯(lián)合國環(huán)境與發(fā)展大會的召開，更加促進了國際上對生物安全立法工作的重視，特別是大會由許多國家簽署的兩個綱領性文件《21世紀議程》和《生物多樣性公約》均在有關條款中提到了生物技術安全問題。

第五十三頁，共五十八頁。1993年，在原國家科學技術委員會領導下成立了國家生物遺傳工程安全委員會，由來自衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部、輕工業(yè)部的專家組成，負責醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和輕工業(yè)部門的生物安全。

目前，在中國負責生物安全的部門有國家環(huán)保總局、科技部、農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家醫(yī)藥管理局、中國科學院和教育部等。

第五十四頁，共五十八頁。1996年7月10日農(nóng)業(yè)部頒布的《農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實施辦法》是一部較完善、較好的“實施辦法”。第五十五頁，共五十八頁。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例中華人民共和國國務院令第304號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》已經(jīng)2001年5月9日國務院第38次常務會議通過，現(xiàn)予公布，自公布之日起施行。

總理朱镕基

2001年5月23日第五十六頁，共五十八頁。植物基因工程一、植物基因工程的載體二、植物基因工程的報告基因三、基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)四、外源DNA導入植物細胞的方法五、轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)和植株的再生六、外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達七、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定技術八、轉(zhuǎn)基因植物的釋放第五十七頁，共五十八頁。內(nèi)容總結(jié)第八章分子育種。植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術及植物組織培