肉毒梭狀芽孢桿菌檢測(cè)

肉毒梭狀芽孢桿菌檢測(cè)第1頁(yè)/共19頁(yè)梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌屬的成員在自然界中是一種非常獨(dú)特的種類(lèi)，當(dāng)其進(jìn)入到反芻動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，常會(huì)引起肌肉和軟組織感染、腸道疾病和神經(jīng)中毒性疾病。梭狀芽孢桿菌引起反芻動(dòng)物發(fā)病的機(jī)理通常是間接地通過(guò)其產(chǎn)生的一種或多種毒素（毒蛋白質(zhì)）來(lái)致病。第2頁(yè)/共19頁(yè)梭狀芽孢桿菌在不同細(xì)菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一般呈圓形、橢圓形、圓柱形。第3頁(yè)/共19頁(yè)梭狀芽孢桿菌在有些細(xì)菌中，芽孢的直徑小于菌體直徑，這些細(xì)菌稱(chēng)為芽孢桿菌，為好氧細(xì)菌；在另一些細(xì)菌中，芽孢的直徑大于菌體直徑，使整個(gè)菌體呈梭形或鼓塑形，這些細(xì)菌稱(chēng)為梭狀芽孢桿菌，為厭氧菌。第4頁(yè)/共19頁(yè)肉毒毒素肉毒毒素（botulinumtoxin，AX）是肉毒桿菌產(chǎn)生的含有高分子蛋白的神經(jīng)毒素，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強(qiáng)烈的生物毒素，它主要抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第5頁(yè)/共19頁(yè)化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

從1964年由肉毒桿菌中分離出毒素結(jié)晶至今已獲得七種（A，B，C，D，E，F(xiàn)和G）類(lèi)型的毒素，能引起人員中毒的主要是A、B和E型毒素，其中以A型軍用意義最大，A型結(jié)晶毒素是由19種氨基酸組成的單一蛋白質(zhì)，分子量為90～120萬(wàn)，化學(xué)結(jié)構(gòu)目前尚不清楚。肉毒毒素通常是由神經(jīng)毒素和血凝素組成的復(fù)合形式存在。A型肉毒毒素的純品是一種白色晶體粉末，易溶于水，但穩(wěn)定性較差。受熱、機(jī)械力和氧的作用而降解。粉末狀的毒素可長(zhǎng)期貯存而不失活性，肉毒毒素染毒的食物和水源，一般其毒性可保持?jǐn)?shù)天乃至一周，肉毒毒素不被胃腸液所破壞，易經(jīng)消化道中毒。第6頁(yè)/共19頁(yè)中毒途徑與毒性

A型肉毒毒素的氣溶膠對(duì)人吸入的致死量為0.3μg，LCt50為0.1～0.5mg·min/m3，靜脈注射致死量為0.15～0.3μg，口服致死劑量為8～10μg，該毒素對(duì)小鼠的毒性L(fǎng)D50值約為3×10–5~3×10–4μg。野外試驗(yàn)表明，由于大規(guī)模施放方法尚未解決，肉毒毒素通過(guò)呼吸道中毒的致死效應(yīng)，并不比等量神經(jīng)性毒劑大。當(dāng)前以污染食物和水源通過(guò)消化道染毒為其主要的中毒途徑。另?yè)?jù)報(bào)道，美軍利用肉毒毒素污染小型武器的彈頭，以增強(qiáng)殺傷效應(yīng)，現(xiàn)已生產(chǎn)這種武器。平時(shí)主要是攝入被肉毒毒素污染的肉類(lèi)和罐頭等食品而中毒，死亡率大約為25～50％。第7頁(yè)/共19頁(yè)中毒機(jī)理

業(yè)已闡明，在體內(nèi)肉毒毒素特異性的與膽堿能神經(jīng)末梢突觸前膜的表面受體相結(jié)合，然后由于吸附性胞飲而內(nèi)轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)稱(chēng)為毒素的內(nèi)轉(zhuǎn)（internalization），使囊泡不能再與突觸前膜融合，從而有效地阻抑了膽堿能神經(jīng)介質(zhì)——乙酰膽堿的釋放。與此同時(shí)，毒素與突觸前膜結(jié)合，還阻塞了神經(jīng)細(xì)胞膜的鈣離子通道，從而干擾了細(xì)胞外鈣離于進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以觸發(fā)胞吐和釋放乙酰膽堿的能力。乙酰膽堿釋放的抑制，有效地阻斷了膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)的生理功能，尤其是神經(jīng)一肌肉接頭部位特別敏感，引起全身隨意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。第8頁(yè)/共19頁(yè)臨床表現(xiàn)

肉毒毒素經(jīng)消化道吸收中毒，一般經(jīng)過(guò)12～72小時(shí)的潛伏期，開(kāi)始出現(xiàn)全身中毒癥狀。早期癥狀有惡心、嘔吐及腹瀉等，繼之出現(xiàn)頭痛、頭昏、眩暈、軟弱無(wú)力，中毒的重要特征為視力紊亂：復(fù)視、斜視、瞳孔散大、視力模糊，同時(shí)伴有眼球震顫，這是眼內(nèi)外肌麻痹的結(jié)果。嚴(yán)重病人有吞噬、咀嚼、語(yǔ)言、呼吸等困難，排痰及抬頭困難，共濟(jì)失調(diào)等，神志清楚。癥狀繼續(xù)發(fā)展則出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難，全身肌肉松弛性麻痹。繼則脈搏加快，血壓下降，短時(shí)間抽搐，意識(shí)喪失，最終因呼吸衰竭、心力衰竭或繼發(fā)肺炎等而死亡。通過(guò)呼吸道吸入中毒，一般癥狀發(fā)展迅速且嚴(yán)重。其他途徑中毒的臨床癥狀，因毒劑的劑量不同而異。病人恢復(fù)較緩慢，視覺(jué)障礙恢復(fù)特慢，有時(shí)需數(shù)月之久。第9頁(yè)/共19頁(yè)肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbotulinum）是可形成芽孢、無(wú)莢膜、有鞭毛的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物具有強(qiáng)大毒性的外毒素肉毒毒素?？煞譃锳，B，C（α，β），D，E，F(xiàn)和G7個(gè)血清型，對(duì)人具有不同程度的致病力。肉毒毒素受高溫、堿性條件、日光直射時(shí)均可被破壞而不穩(wěn)定，但在酸性條件下較穩(wěn)定。引起的中毒是毒素型中毒，毒素作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的顱神經(jīng)核，抑制乙酸膽堿的釋放，引起肌肉麻痹。在厭氧的土壤、江河湖海的淤泥沉積物、塵土和動(dòng)物糞便中有廣泛存在，易污染蔬菜、魚(yú)類(lèi)、肉類(lèi)、豆類(lèi)等蛋白質(zhì)豐富的食品。第10頁(yè)/共19頁(yè)肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌為厭氧性革蘭氏陽(yáng)性桿菌，罐裝食品中引起腐敗的主要菌種，解糖嗜熱梭狀芽孢桿菌（Cl.thermosaccharolyticum）可分解糖類(lèi)引起罐裝水果、蔬菜等食品的產(chǎn)氣性變質(zhì)。腐敗梭狀芽孢桿菌（Cl.putrefaciens）可以引起蛋白質(zhì)食物的變質(zhì)。肉類(lèi)罐裝食品中最重要的是肉毒梭狀芽孢桿菌（Cl.botulinum）,其芽孢產(chǎn)生在菌體的中央或極端，芽孢耐熱性極大，能產(chǎn)生很強(qiáng)的毒素。第11頁(yè)/共19頁(yè)檢驗(yàn)所需器材庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液、肉毒分型抗毒診斷血清、胰酶、革蘭氏染色液等。第12頁(yè)/共19頁(yè)檢驗(yàn)所需器材離心機(jī)及離心管、研缽及細(xì)砂、培養(yǎng)箱、顯微鏡、厭氧培養(yǎng)裝置、1ml和10ml吸管、1ml注射器、平皿、接種環(huán)、載玻片、小白鼠等。第13頁(yè)/共19頁(yè)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序第14頁(yè)/共19頁(yè)肉毒毒素檢測(cè)操作方法

檢樣制備檢出試驗(yàn)確證試驗(yàn)毒力測(cè)定定型試驗(yàn)第15頁(yè)/共19頁(yè)肉毒梭菌檢驗(yàn)操作方法樣品處理增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)第16頁(yè)/共19頁(yè)注意事項(xiàng)典型的肉毒中毒，小白鼠會(huì)在4~6小時(shí)內(nèi)死亡，而且98%~99%的小白鼠會(huì)在12小時(shí)內(nèi)死亡，因此，試驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)的觀察是非常重要的。24小時(shí)后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。如果小白鼠注射1：2或1：5倍數(shù)的稀釋樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是費(fèi)城可以的現(xiàn)象，一般為非特異性死亡。小白鼠