蛋白質(zhì)提取的學(xué)習(xí)教案

蛋白質(zhì)提取的學(xué)習(xí)教案第1頁/共71頁蛋白質(zhì)存在于生物體的組織細(xì)胞中，不同的生物體組織細(xì)胞所含的蛋白質(zhì)種類、數(shù)量也不盡相同。一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)第2頁/共71頁蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳。1、蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象第3頁/共71頁由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。2、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)第4頁/共71頁蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。3、蛋白質(zhì)的沉淀作用第5頁/共71頁在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等?？赡娉恋淼?頁/共71頁在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀第7頁/共71頁蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。4、蛋白質(zhì)的變性第8頁/共71頁蛋白質(zhì)的變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等。第9頁/共71頁大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。5、蛋白質(zhì)的紫外吸收第10頁/共71頁要研究某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，就必須將這種蛋白質(zhì)從組織細(xì)胞中分離、純化出來。因此，蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)便成為蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。二、蛋白質(zhì)分離和純化第11頁/共71頁研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)隨時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)活性并檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。第12頁/共71頁(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用有機(jī)溶劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)提純：可用層析法、電泳法等進(jìn)行提純。(5)成品加工：測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。1．蛋白質(zhì)的分離步驟第13頁/共71頁血紅蛋白提取和分離步驟具體操作步驟（一）（二）（三）（四）第14頁/共71頁血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（）90％血液組成成分第15頁/共71頁1.洗滌紅細(xì)胞1.1洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白1.2洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有防止破壞紅細(xì)胞，使血紅蛋白流失（一）樣品處理黃色第16頁/共71頁2.血紅蛋白的釋放原理：紅細(xì)胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白第17頁/共71頁3.分離血紅蛋白溶液分離過程：紅細(xì)胞混合液離心管甲苯層脂類物質(zhì)血紅蛋白層破碎物沉淀層高速離心10min濾紙過濾脂類物質(zhì)沉淀物燒杯分液漏斗第18頁/共71頁20mmol/L磷酸緩沖液透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)（二）粗分離——透析血紅蛋白第19頁/共71頁★注意事項(xiàng)★（1）生理鹽水作用？（3）兩次離心的差異？（4）透析袋的作用機(jī)理？模擬紅細(xì)胞生存環(huán)境，保持紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。破碎紅細(xì)胞；溶解細(xì)胞膜釋放血紅蛋白。前慢后快，前短后長(zhǎng)。滲透作用（2）蒸餾水和甲苯的作用？第20頁/共71頁離心沉降法凝膠色譜法萃取法層析法電泳法（三）純化第21頁/共71頁1.凝膠色譜法

（1）原理：（2）材料：凝膠大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道.根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法概念：凝膠色譜法純化蛋白質(zhì)第22頁/共71頁洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃?dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子

第23頁/共71頁第24頁/共71頁1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程（四）純度鑒定—電泳第25頁/共71頁2）電泳結(jié)果分析如果出現(xiàn)一個(gè)條帶：樣品中含有一個(gè)分子質(zhì)量級(jí)別多肽；

如果出現(xiàn)兩個(gè)條帶：樣品中含有兩個(gè)分子質(zhì)量級(jí)別多肽。

第26頁/共71頁由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等3）緩沖溶液－－洗脫劑

作用：

配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。

思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液？第27頁/共71頁實(shí)驗(yàn)四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳【目的要求】1、掌握電泳技術(shù)的一般原理和基本操作過程。2、熟悉血清中蛋白分類以及電泳分離操作。第28頁/共71頁【實(shí)驗(yàn)原理】

1.電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，它們的電泳遷移率不同。第29頁/共71頁V=EQ/(6πrη)M=V/E=Q/(6πrη)V：電泳速度M：遷移率E：電場(chǎng)強(qiáng)度Q：顆粒帶電荷量r：球形分子半徑η：介質(zhì)粘度第30頁/共71頁【實(shí)驗(yàn)原理】

2.影響電泳的因素：

內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象第31頁/共71頁影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素

決定運(yùn)動(dòng)方向電場(chǎng)作用力形成阻力決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√第32頁/共71頁3.醋酸纖維素溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)第33頁/共71頁血清蛋白參考值等電點(diǎn)分子量（kDa）占總蛋白的百分?jǐn)?shù)(%)清蛋白4.646961~71α1球蛋白5.062003~4α2球蛋白5.063006~10β球蛋白5.1290~1507~11γ球蛋白6.85156~9509~18第34頁/共71頁4.經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)的百分含量。第35頁/共71頁【實(shí)驗(yàn)器材】1.DYY-6C型

雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀和DYY-Ⅲ型電泳槽2.醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）：1片/人。3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點(diǎn)樣器：載玻片。5.濾紙：公用。6.鑷子：一個(gè)/組。第36頁/共71頁【實(shí)驗(yàn)試劑】1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強(qiáng)度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液第37頁/共71頁1.浸泡將2×8cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于點(diǎn)樣?！緦?shí)驗(yàn)操作】第38頁/共71頁

2.點(diǎn)樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，迎光判斷光面與無光澤面。用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，垂直按壓于醋纖膜標(biāo)號(hào)一端約1.5-2㎝處(約2～3μl)第39頁/共71頁3.電泳將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極濾紙橋上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充滿緩沖液；而后電壓120V，電流0.4～0.6mA/㎝，通電45分鐘。

第40頁/共71頁4.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡3-5min第41頁/共71頁5.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次(3-4次)，直至條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。第42頁/共71頁6.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。第43頁/共71頁【注意事項(xiàng)】1、點(diǎn)樣前，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。2、薄膜的浸潤(rùn)與選擇正確膜面是電泳成敗的關(guān)鍵之一。3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。4.手盡量不要觸及薄膜，用鑷子夾取。5、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。垂直點(diǎn)樣。6、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。7、電泳開始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進(jìn)行，要先關(guān)閉電源。8、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。第44頁/共71頁【思考題】電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確操作？第45頁/共71頁本堂小結(jié)本節(jié)內(nèi)容目標(biāo)：血紅蛋白的分離和純化獲取紅細(xì)胞（離心）破碎紅細(xì)胞，釋放血紅蛋白從各紅細(xì)胞的成分中獲取血紅蛋白（離心）初步純化血紅蛋白（透析）第46頁/共71頁從生物材料中提取某些特定成分第47頁/共71頁背景知識(shí)早在古代，人類就已發(fā)現(xiàn)芳香氣味的植株或花卉能使人神清氣爽，將這些植物制成干品后，可當(dāng)做藥物和香料使用。但是，植物香料易揮發(fā)，不易儲(chǔ)存。歐洲中世紀(jì)香料貿(mào)易的發(fā)展，促成了植物芳香油提取技術(shù)的誕生。第48頁/共71頁

16世紀(jì)，制備植物芳香油的技術(shù)已相當(dāng)成熟。19世紀(jì)，有機(jī)化學(xué)迅速發(fā)展，人們通過分析植物芳香油的化學(xué)成分，找到了芳香的根源，進(jìn)而合成了人造香料。如今，植物芳香油廣泛地應(yīng)用于輕工、化妝品、飲料和食品制造的方面。第49頁/共71頁基礎(chǔ)知識(shí)動(dòng)物：植物：微生物：主要來源于麝、靈貓、海貍和抹香鯨等天然香料的來源根、莖、葉、花、果實(shí)、種子真菌第50頁/共71頁植物芳香油的物理性質(zhì):植物芳香油的化學(xué)本質(zhì):具有很強(qiáng)的揮發(fā)性主要包括萜類化合物及其衍生物第51頁/共71頁植物芳香油的提取方法：植物芳香油選擇方法的依據(jù)：根據(jù)植物原料的特點(diǎn)來決定蒸餾、壓榨、萃取第52頁/共71頁提取植物芳香油的常用方法：提取植物芳香油常用方法的原理：水蒸氣蒸餾法：水中蒸餾法、水上蒸餾法、水氣蒸餾法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強(qiáng)的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，油水混合物又重新分出油層和水層第53頁/共71頁水中蒸餾適于某些鮮花、破碎果皮和不易粘結(jié)的原料。但水中蒸餾精油中的酯類成分易水解，所以含酯類高的香料植物不能采用這種方法。1.水中蒸餾第54頁/共71頁又稱隔水蒸餾，是把原料置于蒸餾鍋內(nèi)的篩板上，篩板下盛放一定水量以滿足蒸餾操作所需的足夠的飽和蒸汽，水層高度以水沸騰時(shí)不濺濕原料底層為原則。2.水上蒸餾第55頁/共71頁水上蒸餾應(yīng)用較廣，大面積種植的芳香植物為薄荷、香茅、桉樹葉等都用水上蒸餾提取精油；此法也適用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。第56頁/共71頁是由外來的鍋爐蒸汽直接進(jìn)行蒸餾。通常在篩板下鍋底部位裝有一條開小孔的環(huán)形管，鍋爐來的蒸汽通過小孔直接噴出。通過篩板的篩孔進(jìn)入原料層加熱原料。由鍋爐來的蒸汽是具有一定蒸汽壓力，溫度較高而含濕量又較低的飽和蒸汽，能很快加熱料層，因此，對(duì)干料加熱蒸餾時(shí)，干料必須在裝鍋前預(yù)先濕透。直接蒸汽蒸餾，其蒸餾速度快，溫度高，可縮短蒸餾時(shí)間，高沸點(diǎn)的成分可蒸出，出油率高。3.直接蒸汽蒸餾第57頁/共71頁

因?yàn)樗姓麴s會(huì)導(dǎo)致原料焦糊和有效成分水解等問題原因：提取柑橘芳香油的方法：通常用壓榨法第58頁/共71頁萃取法的原理：將粉碎、干燥的植物原料用有機(jī)溶劑浸泡，使芳香油溶解在有機(jī)溶劑中的方法。芳香油溶解于有機(jī)溶劑后，只需蒸發(fā)出有機(jī)溶劑，就可以獲得純凈的植物芳香油了。第59頁/共71頁比較項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)原理方法步驟適用范圍水蒸氣蒸餾法萃取法壓榨法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強(qiáng)的植物芳香油攜帶出來使芳香油溶解在有機(jī)溶劑中，蒸發(fā)后得到芳香油通過機(jī)械加壓，壓榨出果皮中的芳香油①水蒸汽蒸餾②分離油層③除水過濾①粉碎、干燥②萃取、過濾③濃縮①石灰水浸泡、漂洗②壓榨過濾靜置③再次過濾提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性強(qiáng)的芳香油原料顆粒盡可能細(xì)小，能充分浸泡在有機(jī)溶劑中適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提取植物芳香油提取三種方法的比較第60頁/共71頁1、提取方法：水蒸氣蒸餾法一、玫瑰精油的提?。簩?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)玫瑰精油的提取裝置：第61頁/共71頁3、實(shí)驗(yàn)步驟：

①采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬）的玫瑰花，清水清洗瀝干。

②裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水。③安裝蒸餾裝置：所有儀器必須事先干燥，保證無水。④加熱蒸餾第62頁/共71頁⑤拆卸蒸餾裝置：

⑥分離油層：

蒸餾完畢，應(yīng)先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時(shí)相反。

收集錐形瓶中的乳濁液，向錐形瓶中加入質(zhì)量濃度為0.1g／mL的NaCl，然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水完全分開。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。⑦除去水分：

向接收瓶加入無水Na2S04，24h后過濾，得到玫瑰油。注意事項(xiàng)：蒸餾時(shí)間不能過短，溫度不能過高。第63頁/共71頁鮮玫瑰花+清水水蒸氣蒸餾油水混合物油水分離除水玫瑰油加無水Na2SO4加NaCl氯化鈉：促使油水混合物（乳濁液中油和水的分離。無水