蛋白質(zhì)講解的學(xué)習(xí)資料

蛋白質(zhì)講解的學(xué)習(xí)資料第1頁/共45頁一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的分子大小與形狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)分離純的一般原則五、蛋白質(zhì)混合物的分離方法六、蛋白質(zhì)含量的測定與純度鑒定第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化p290第2頁/共45頁蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。對某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。一、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點第3頁/共45頁蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：擴(kuò)散慢、易沉降、粘度大、不能透過半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體，具有丁達(dá)爾現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個因素時，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。二、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)第4頁/共45頁

使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：1.鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。三、蛋白質(zhì)的沉淀作用第5頁/共45頁2.有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。3.重金屬鹽沉淀（條件：pH稍大于pI為宜）：在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會使蛋白質(zhì)沉淀。重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。重金屬沉淀蛋白質(zhì)會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對機(jī)體的損害。三、蛋白質(zhì)的沉淀作用第6頁/共45頁4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。

“柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”。5.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點處，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。第7頁/共45頁

1.蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。2.使蛋白質(zhì)變性的因素1）物理因素：高溫、高壓、射線等

2）化學(xué)因素：強酸、強堿、重金屬鹽、去污劑等3.變性的本質(zhì)：分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。四、蛋白質(zhì)的變性作用、結(jié)絮和凝固第8頁/共45頁4.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：1）生物學(xué)活性消失

2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強，對酶的作用敏感，易被水解。五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測定有關(guān)：

1.茚三酮反應(yīng)：2.雙縮脲反應(yīng)：3.酚試劑反應(yīng)：

六、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征

蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（280nm處）有光吸收：

色（Trp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）。

蛋白質(zhì)的變性作用、結(jié)絮和凝固第9頁/共45頁電泳

前處理粗分離細(xì)分離生物組織

無細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過濾疏水層析吸附層析純化的實質(zhì)：增加制品的純度或比活性五、蛋白質(zhì)的分離純化的一般原則第10頁/共45頁1、粗分級（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）②等電點選擇性沉淀法③有機(jī)溶劑分級沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法五、蛋白質(zhì)的分離純化的一般原則第11頁/共45頁2、細(xì)分級（finefractionation)①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過濾除鹽層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心第12頁/共45頁根據(jù)分子大小根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度根據(jù)電荷差異選擇性吸附分離（物理吸附）根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）六、

分離純化蛋白質(zhì)的主要方法p301第13頁/共45頁測分子量的方法：化學(xué)組成法測定最低分子量SDS法凝膠過濾法滲透壓法擴(kuò)散系數(shù)法沉降系數(shù)法和沉降平衡法(一）、蛋白質(zhì)的大小與形狀第14頁/共45頁1.根據(jù)分子組成測定最小分子量

p291如肌紅蛋白含0.335%的鐵

Fe分子量55.8最小M＝Fe(%)=0.335=16700

(實為16900馬心)牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200，實際為69000，含2個Trp*100測分子量的方法第15頁/共45頁2、葡聚糖凝膠過濾法分析蛋白質(zhì)分子量

p297-298測分子量的方法交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP，）

瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-GelA）第16頁/共45頁第17頁/共45頁柱床體積Vt=Vo+Vi洗脫體積Ve=Vo+kd·Vi

第18頁/共45頁①當(dāng)kd=0時，Ve=Vo，溶質(zhì)全從Vo出來，無分配。②當(dāng)kd=1時，Ve=Vo+Vi，溶質(zhì)全進(jìn)篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但各物質(zhì)不能分開。③當(dāng)0〈kd〈1時，Ve=Vo+kd·Vi,各溶質(zhì)具不同分配，得以分離第19頁/共45頁p298第20頁/共45頁交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）第21頁/共45頁第22頁/共45頁3.據(jù)pr的滲透壓

p292

用一半透膜將pr溶液與純水隔開，當(dāng)滲透達(dá)平衡時，測定其滲透壓，計算分子量：C：濃度（克/升）R：氣體常數(shù)（0.082升/大氣壓/克分子/K開氏溫度）T：絕對溫度（開氏溫度）：以大氣壓表示的滲透壓測分子量的方法第23頁/共45頁半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子第24頁/共45頁4.SDS—PAGE

p298（十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳）測分子量的方法第25頁/共45頁極性頭部非極性尾巴SDS

是一種表面活性劑sodiumdodecyl

sulfateStryer(1995)Biochemistry(4e)p.275第26頁/共45頁沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度測分子量的方法5.沉降分析法第27頁/共45頁蔗糖濃度0.25M1.00M2.00M0.50M加液層由于顏色的顯著不同，可以非常容易地識別螺旋藻光合作用色素：樣品層上部為黃色的胡蘿卜素層，下部是綠色的葉綠素層，蔗糖濃度為0.25M的區(qū)帶最上端是少量的天藍(lán)色(淡藍(lán)色)的游離狀態(tài)的異藻藍(lán)蛋白，0.25M層的大部分為藍(lán)色的藻藍(lán)蛋白,是自藻膽體脫落下來的藻藍(lán)蛋白的“桿”的片段，有時可延伸分布至0.5M層的上端。1M層是藍(lán)紫色的藻膽體層。第28頁/共45頁p295,沉降系數(shù):

把10-13秒作為一個單位，稱為斯維得貝格單位，或沉降系數(shù)單位，用S（大寫）表示。第29頁/共45頁1、等電點沉淀

P305在等電點條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大在pI時，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀2、蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析

P305鹽溶：低鹽濃度時，蛋白質(zhì)溶解度↑，稱鹽溶。鹽析：高鹽濃度時，使pr溶解度↓析出，稱鹽析。鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液(二）、根據(jù)溶解度差異的分離：選擇性沉淀法第30頁/共45頁1、電泳和等電聚焦法：普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳從裝置上分：圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。從支持物分：自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、凝膠電泳（PAGE，瓊脂糖膠，淀粉膠等）（三）根據(jù)電荷性質(zhì)的差異:P307-312第31頁/共45頁第32頁/共45頁等電聚焦電泳法可測定蛋白質(zhì)pI第33頁/共45頁第34頁/共45頁2Dgelinproteomics第35頁/共45頁2、離子交換層析法：P310離子交換纖維素：離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng)離子交換交聯(lián)瓊脂糖：第36頁/共45頁交聯(lián)葡聚糖離子交換劑P310表7-6陰離子陽離子第37頁/共45頁極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵）最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結(jié)晶磷酸鈣[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分離蛋白質(zhì)、核酸，與DNA的親和力最高。非極性：苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖（范德華力、疏水作用）根據(jù)疏水性的差異：疏水層析和反相HPLC（四）根據(jù)選擇性吸附的差異：吸附層析法第38頁/共45頁親和層析(affinitychromatography)：是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，也即生物學(xué)親和力，建立起來的一種有效的純化方法。免疫親和層析凝集素親和層析金屬螯和層析染料配體層析（五）配體親和力的差異：親和層析第39頁/共45頁親和層析第40頁/共45頁七、蛋白制品的含量分析、純度鑒定與活性分析p315（一）、含量分析總蛋白含量分析：凱氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法特定蛋白組分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗體反應(yīng)(westernblot)第41頁/共45頁（二）純度鑒定（均一性）基本手段：電泳分析：單條帶。

N端測定：n亞基蛋白有1-n個N端aa。選用手段：沉降分析、溶解度分析、