血清LDH同工酶測定

血清LDH同工酶測定第1頁/共49頁關(guān)于同工酶1957年Markert等人用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶(LDH)分離出5條區(qū)帶，由陽極到陰極依次命名為LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它們均具有LDH催化活性，從而首先在1959年提出了同工酶的概念。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第2頁/共49頁同工酶:來源于同一個(gè)體或組織，能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。最典型的同工酶是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第3頁/共49頁為什么要進(jìn)行血清LDH同工酶測定？南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第4頁/共49頁南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)中的應(yīng)用：可用于研究物種進(jìn)化、遺傳變異、雜交育種和個(gè)體發(fā)育、組織分化等。例如最原始的脊椎動(dòng)物七鰓鰻只有一種LDH肽鏈，進(jìn)化到較高級(jí)的魚類才有A、B兩類肽鏈；LDH同工酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，動(dòng)物各組織中LDH同工酶各組分含量不同，具有明顯的物種間差異可作為動(dòng)物分類的生化依據(jù)。同工酶的應(yīng)用第5頁/共49頁

文獻(xiàn)：鲿科四種魚LDH同工酶譜的研究【摘要】：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)鲿科四種魚血清中LDH同工酶進(jìn)行電泳分析,結(jié)果表明:四種魚血清LDH同工酶圖譜的區(qū)帶分布具有種的特異性;四種魚血清LDH同工酶A、B亞基比例關(guān)系反映的各品種間親緣的關(guān)系與形態(tài)學(xué)特征分析結(jié)果吻合,為鲿科四種魚分類提供進(jìn)一步的理論依據(jù).南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院同工酶的應(yīng)用第6頁/共49頁是否人種間在差異呢？這個(gè)答案不得而知，但有一點(diǎn)是明確的，那就是LDH同工酶在人體不同器官和組織間是有差異的，從醫(yī)學(xué)角度來講，利用這種特異性臨床上對(duì)LDH同工酶的檢測可作為某些疾病診斷的依據(jù)之一。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院同工酶的應(yīng)用第7頁/共49頁南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院

在臨床檢驗(yàn)方面，通過觀測病人血清中LDH同工酶的電泳圖譜，輔助診斷哪些器官組織發(fā)生病變，遠(yuǎn)較單純測定血清LDH總活性的方法敏感。例如，心肌受損病人血清LDH1含量上升，肝細(xì)胞受損者血清LDH5含量增高。同工酶的應(yīng)用第8頁/共49頁一、LD同工酶的形式南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院H（heart）、M（muscle）第9頁/共49頁南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院二、LD同工酶的分布第10頁/共49頁南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織中的比例不同，心肌中以LDH1及LDH2較為豐富，骨骼肌及肝中含LDH5及LDH4較多。這都與它們的生理功能關(guān)。LDH1和LDH2對(duì)乳酸親和力高，易使乳酸脫氫氧化生成丙酮酸，后者進(jìn)一步氧化可釋放出能量供心肌活動(dòng)的需要；LDH5與LDH4對(duì)丙酮酸的親和力高，而使它得氫還原成乳酸，這對(duì)保證肌肉在短暫缺氧時(shí)仍可獲得能量有關(guān)。

乳酸脫氫酶同工酶第11頁/共49頁---瓊脂糖：直鏈多糖，半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成，主要通過氫鍵形成凝膠。凝膠電泳其優(yōu)點(diǎn)如下：①操作簡單，電泳速度快②凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大，對(duì)蛋白質(zhì)吸附極少，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。③電泳區(qū)帶易染色，可透明直接掃描、可長期保存等優(yōu)點(diǎn)。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院瓊脂糖凝膠電泳第12頁/共49頁1、瓊脂糖凝膠電泳法原理

根據(jù)LD同工酶一級(jí)結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的差異，在一定電泳條件下，使LD在支持物上被分離。利用酶促反應(yīng)進(jìn)行顯色，顯色深淺與酶活性成正比，利用光密度掃描儀可求出各同工酶的相對(duì)含量南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第13頁/共49頁柱層析法免疫化學(xué)法熱穩(wěn)定性和抑制法*電泳法：醋酸纖維薄膜聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠三、測定方法南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第14頁/共49頁LDH

在電泳中的分離因素

電荷因素蛋白質(zhì)分子形狀和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同分子大小蛋白質(zhì)分子形狀和所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子大小不同分子形狀蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子形狀不同電荷因素分子大小分子形狀南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第15頁/共49頁

以乳酸鈉為底物,LDH催化乳酸脫氫生成丙酮酸,同時(shí)使氧化型輔酶INAD+還原為NADH,NADH又將氫傳遞給吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS),PMS再將氫傳遞給氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT),使其還原為紫藍(lán)色化合物,因此有LDH活性的區(qū)帶即著紫藍(lán)色且顏色深淺與LDH活性成正比.1、LDH同工酶瓊脂糖凝膠電泳顯色原理南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第16頁/共49頁緩沖液條：內(nèi)含pH8.4、離子強(qiáng)度0.075的巴比妥緩沖液緩沖瓊脂糖凝膠板：內(nèi)含0.08mol/L，pH8.3巴比妥-鹽酸緩沖液EDTA-Na2溶液（10mmol/L），5g/L瓊脂糖底物顯色液（臨用前配制）固定漂洗液2、試劑南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第17頁/共49頁打開儀器，選擇電泳程序點(diǎn)樣、保濕，放電極架、掛緩沖條、放凝膠板放點(diǎn)樣梳、電泳，配顯色液加顯色液吸掉顯色液、加固定液吸掉固定液、放厚濾紙烘干膠片掃描3、操作南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第18頁/共49頁4、計(jì)算

A總（吸光度總和）=A1+A2+A3+A4+A5（A1-A5相應(yīng)為LD同工酶LD1-LD5的吸光度。）LD同工酶的百分比（%）為：LD1=A1/A總

×100%LD2=A2/A總

×100%LD3=A3/A總

×100%LD4=A4/A總

×100%LD5=A5/A總

×100%南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第19頁/共49頁5、注意事項(xiàng)不宜用溶血標(biāo)本。嚴(yán)格控制溫度（LD4和LD5，特別是LD5對(duì)熱敏感，如底物顯色液溫度超過50℃，LD5易失活）。底物顯色液需避光保存，因PMS對(duì)光敏感，否則顯色后的凝膠板背景顏色深而影響結(jié)果。LD同工酶對(duì)冷的敏感性不同，尤其是LD5對(duì)冷不穩(wěn)定。因此血清標(biāo)本應(yīng)該放室溫保存南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第20頁/共49頁6、圖譜分析-1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第21頁/共49頁6、圖譜分析-1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院正常：LDH2>LDH1>LDH3>LDH4>LDH5參考值(瓊脂糖電泳法)：LDH1（28.4±5.3）%；LDH2（41.0±5.0）%；LDH3（19.0±4.0）%；LDH4（6.6±3.5）%；LDH5（4.6±3.0）%。第22頁/共49頁6、圖譜分析-1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院

文獻(xiàn)：兒童血清LDH及同工酶分析[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2008,9(11):79-80.兒童組與成人組LDH及LDH同工酶(醋纖電泳法)結(jié)果比較注：與成人組比較，﹩p<0.01組別nLDH(U/L)LDH1(%)LDH2(%)LDH3(%)LDH4(%)LDH5(%)兒童組445196.1-254.5﹩26.2±32.834±37.417.9±22.36.8±11.04.7±7.1成人組59271-20420.3±32.128.2±38.813.7±21.78.7±16.77.4±16.0第23頁/共49頁6、圖譜分析-2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第24頁/共49頁6、圖譜分析-2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院心臟?。篖DH1>LDH2

文獻(xiàn)：LDH同工酶分析在心臟病診療中的探討.不同心臟病患者LDH1與2結(jié)果比較8例心臟病患者手術(shù)后LDH1不同時(shí)間吸光度的變化

10分鐘11.52小時(shí)26.56

20分鐘12.86小時(shí)28.56

40分鐘14.112小時(shí)26.75

60分鐘18.124小時(shí)23.1

注：與心肌梗塞組比較，﹩p<0.01病種nLDH1(%)LDH2(%)心肌梗塞14543.8729.43不穩(wěn)定心絞痛13134.74

﹩28.95心肌炎6635.67﹩28.02非心臟病7834.9﹩28.09第25頁/共49頁6、圖譜分析-2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院

一例以“M”亞基為主體的心肌梗塞絕大多數(shù)心肌梗塞患者LDH1、2區(qū)帶明顯升高，而LDH1>LDH2，也有少數(shù)病例表現(xiàn)為LDH1、5區(qū)帶同時(shí)升高，這類病人除心肌梗塞外還伴有充血性心力衰竭，由予缺氧，缺血，使肝細(xì)胞通透性增高，向血中釋放大量LDH5所致。該病例特殊表現(xiàn)為LDH5區(qū)帶高二度增加(LDH5占68％)，而其它LDH1周工酶成分相應(yīng)大幅度下降，尤以LDH1減少更為著占4％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)心肌梗塞病人以“M”亞基為主體時(shí)患者很快死亡。第26頁/共49頁6、圖譜分析-2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院LDH1/LDH2比值＞1還見于溶血性貧血、惡性貧血、鐮形細(xì)胞性貧血、腎臟損傷、腎皮質(zhì)梗塞(皮質(zhì)以LDH1和LDH2含量較高)等腦干含LDH1較高。顱腦損傷僅累及大腦半球時(shí)，只有血清同工酶譜的絕對(duì)值增高，而不影響同工酶的相互比值，如果累及腦干時(shí)，病人血清LDH1的含量也增高。胚胎細(xì)胞瘤病人的血清LDH1活性升高。第27頁/共49頁6、圖譜分析-3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第28頁/共49頁6、圖譜分析-3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝細(xì)胞損傷或壞死后，向血流釋入大量的LDH4和LDH5，致使血中LDH5/LDH4比值升高，故LDH5/LDH4＞1可做為肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)。急性肝炎以LDH5明顯升高，LDH4不增，LDH5/LDH4＞1為特征；若血清LDH5持續(xù)升高或下降后再度升高，則可認(rèn)為是慢性肝炎；肝昏迷病人的血清LDH5、LDH4活性極高時(shí)，常示預(yù)后不良；原發(fā)性肝癌以血清LDH4＞LDH5較為常見，阻塞性黃疸時(shí)LDH4與LDH5均增高，但以LDH4尤為明顯。第29頁/共49頁6、圖譜分析-3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院文獻(xiàn)：血清乳酸脫氫酶同工酶在肝臟疾病中的檢測及意義摘要:目的探討血清乳酸脫氫酶同工酶檢測在肝臟疾病中的臨床意義。方法

LDH同工酶測定采用瓊脂糖電泳法，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。結(jié)果

LDH1在急性肝炎和亞急性重型肝炎中顯著低于正常下限(P<0.001)，LDH2在急性肝炎、慢性肝炎、慢性肝炎、亞急性重型肝炎和肝硬化中明顯低于正常值(P<001)，LDH3在急性肝炎、慢性肝炎、亞急性重型肝炎、慢性重型肝炎和肝硬化的患者中顯著低于正常下限(P<0．001)，LDH4在慢性肝炎、慢性重型肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者中也明顯低于正常水平(P<0．0l或P<0．001)，LDH5在急性肝炎、慢性肝炎、亞急性重型肝炎、慢性重型肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者中均有顯著上升(P<0．01或P<0．001)。結(jié)論在肝炎患者血清檢測中，LDH同工酶的測定特異性較好,有助于對(duì)急慢性肝炎和肝細(xì)胞損害的診斷。第30頁/共49頁6、圖譜分析-3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院LDH5↑：骨骼肌損傷(杜氏肌營養(yǎng)不良、橫紋肌融解癥、肌肉外傷)煤礦、鎢礦矽肺病人的血清LDH1、LDH2下降，LDH4、LDH5升高腎髓質(zhì)以LDH4和LDH5活性較強(qiáng)?；技毙阅I小管壞死、慢性腎盂腎炎、慢性腎小球腎炎以及腎移植排異時(shí)，血清LDH5均可↑

第31頁/共49頁6、圖譜分析-4南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院惡性腫瘤第32頁/共49頁6、圖譜分析-4南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院惡性腫瘤LDH增高多為中間型，以LDH3為主，LDH3＞LDH1,總LDH越高預(yù)后越差。LDH2、LDH3↑：肺癌、粒細(xì)胞白血病第33頁/共49頁6、圖譜分析-4南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院不同腫瘤患者血清乳酸脫氫酶正常和升高者其同工酶的水平觀察分析摘要：目的為了探討不同腫瘤患者血清乳酸脫氫酶(LDH)正常和升高者其同工酶是否一致。方法用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)309例血清LDH正常和276例LDH升高的不同腫瘤患者以及37例正常人的LDH同工酶水平進(jìn)行觀察.結(jié)果血清LDH活性正常的不同腫瘤患者LDH同工酶存在著LD3↑的普遍規(guī)律，與正常對(duì)照組存在著非常顯著性差異；血清LDH活性升高的不同腫瘤患者LDH同工酶存在著LDH3/LDH4/LDH5↑的普遍規(guī)律,與正常對(duì)照組相比差異有非常顯著性。結(jié)論

LDH同工酶可作為惡性腫瘤患者診斷的參考指標(biāo)，特別是LDH活性正常的腫瘤患者同樣存在著LDH同工酶譜的異常，LDH3↑是惡性腫瘤的早期特征之一。

第34頁/共49頁6、圖譜分析-4南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院肺含LDH3較多，肺部疾患時(shí)血清LDH3?？缮?。肺梗塞:LDH3=LDH4↑，LDH1↓↓；肺膿腫:LDH3、LDH4常與LDH5同時(shí)↑LDH3、LDH4↑:淋巴瘤、結(jié)締組織疾病和凝血紊亂（血小板增多癥、凝血活酶釋放）。第35頁/共49頁小結(jié)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院LDH同工酶分類1.ppt、測方法2.pptLDH同工酶測定原理3.pptLDH同工酶檢測的臨床意義4.ppt（圖譜分析）第36頁/共49頁1、LDH是由兩種不同的亞基組成的四聚體，形成以下5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶

A.LD1（H4）/LD2（H3M1）/LD3（H2M2）/LD5（HM3）/LD4（M4）

B.LD2（H4）/LD1（H3M1）/LD3（H2M2）/LD5（HM3）/LD4（M4）

C.LD1（H4）/LD2（H3M1）/LD3（H2M2）/LD4（HM3）/LD5（M4）

D.LD3（H4）/LD1（H3M1）/LD2（H2M2）/LD5（HM3）/LD4（M4）

E.LD5（H4）/LD4（H3M1）/LD3（H2M2）/LD2（HM3）/LD1（M4）

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第37頁/共49頁2、LDH同工酶在我科使用的檢測方法是

A.免疫化學(xué)法B.瓊脂糖凝膠電泳法C.柱層析法D.熱穩(wěn)定性和抑制法

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第38頁/共49頁3、LDH同工酶瓊脂糖凝膠電泳顯色是A、酶的催化反應(yīng)進(jìn)行顯色B、麗春紅S染色C、氨基黑10B染色D、與帶負(fù)電荷染料溴甲酚綠結(jié)合顯色E、與帶負(fù)電荷染料溴甲酚紫結(jié)合顯色

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第39頁/共49頁4、LDH同工酶電泳參與顯色反應(yīng)易見光分解的是A、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)B、乳酸鈉C、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)D、輔酶INAD+E、巴比妥緩沖液

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第40頁/共49頁5、下列哪個(gè)物質(zhì)是LDH同工酶瓊脂糖電泳酶促反應(yīng)的底物A、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)B、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)C、輔酶INAD+D、巴比妥緩沖液

E、乳酸鈉

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第41頁/共49頁6、LDH同功酶電泳圖譜從正極到負(fù)極依次是

A、LD1、LD2、LD3、LD5、LD4B、LD2、LD1、LD3、LD4、LD5C、LD3、LD1、LD2、LD4、LD5D、LD4、LD5、LD3、LD1、LD2E、LD1、LD2、LD3、LD4、LD5

南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院小結(jié)第42頁/共49頁7、一男性患者35歲，胸痛9天，血液分析示白細(xì)胞19.1×109、中性粒細(xì)胞85%，LDH同功酶電泳圖譜出現(xiàn)LD1＞LD2

反轉(zhuǎn)變化，最有可能的診斷是

A、AMIB、溶血性貧血C、巨細(xì)胞性貧血D、惡性腫瘤E、肌