基因工程醫(yī)學知識講座

基因工程醫(yī)學知識講座基因工程醫(yī)學知識講座第1頁二、基因工程中常見工具酶將目標基因片斷從細胞內(nèi)提取，需要基因剪刀——限制性內(nèi)切酶。將目標基因與運載體DNA連接，需要基因針線——DNA連接酶。3.合成第二條cDNA鏈或用于標識DNA——大腸桿菌DNA聚合酶基因工程醫(yī)學知識講座第2頁限制性內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補配對）。舉例：大腸桿菌一個限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。一個限制酶只能識別一個特定核苷酸序列，并在特定切割點上將DNA分子切斷。當前已發(fā)覺限制酶有200各種?；蚬こ提t(yī)學知識講座第3頁限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放基因工程醫(yī)學知識講座第4頁DNA連接酶連接酶作用：DNA連接酶是將堿基互補配正確兩個黏性末端連接起來，封閉DNA鏈上缺口，使之成為一個完整DNA分子

連接部位：能夠催化DNA鏈上5-PO4與3-OH生成磷酸二脂鍵?？捎糜趯⒛繕嘶蚺c載體DNA連接起來。

基因工程醫(yī)學知識講座第5頁DNA連接酶作用過程點擊播放基因工程醫(yī)學知識講座第6頁基因工程載體作用：將外源基因送入受體細胞。條件：能在宿主細胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保留。含有多個限制酶切點。含有一些標識基因種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。

要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來基因在乙生物體內(nèi)進行表示，首先得將這個基因送到乙生物細胞內(nèi)去。載體是能將目標基因片段送入宿主細胞工具，在基因工程中可與包含目標基因外源DNA片段連接組成重組體，并將重組體導入宿主細胞。

基因工程醫(yī)學知識講座第7頁基因工程中常見載體細菌或酵母質(zhì)粒：環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因載體。

最常見細菌質(zhì)粒：大腸桿菌質(zhì)粒pBR322λ噬菌體：線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因載體,是最常見噬菌體?；蚬こ提t(yī)學知識講座第8頁質(zhì)粒特點

質(zhì)粒是細菌、真菌及少數(shù)其它生物細胞中自然存在于細胞染色體外能自主復(fù)制DNA分子，大個別為小型環(huán)狀雙鏈DNA。

細胞染色體外能自主復(fù)制小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常見運載體；最常見質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒；存在于許多細菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒存在對宿主細胞無影響；質(zhì)粒復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)完成。基因工程中常見受體細胞為細菌及動植物細胞等。

基因工程醫(yī)學知識講座第9頁三、基因操作基礎(chǔ)步驟目標基因?qū)ふ?、取?/p>

結(jié)構(gòu)重組DNA分子

將目標基因?qū)胧荏w（經(jīng)過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）并進行擴增（復(fù)制表示和遺傳）對受體細胞進行篩選和判定，篩出含有重組DNA細胞經(jīng)過發(fā)酵、細胞培養(yǎng)等伎倆最終取得所需要產(chǎn)物，并進行分離純化，或者取得所需要遺傳性狀。

視頻基因工程醫(yī)學知識講座第10頁經(jīng)典基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因基因工程醫(yī)學知識講座第11頁1、提取目標基因?qū)⑿枰驈墓w生物細胞內(nèi)提取出來。取出DNA用限制酶切斷DNA

當前被較廣泛提取使用目標基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等?；蚬こ提t(yī)學知識講座第12頁將總DNA提取分離，然后用限制性內(nèi)切酶將總DNA切開成為許多小片段，將這些基因組片段分別克隆在載體上，便組成該生物基因文庫。普通用與目標基因個別序列互補并標識了放射性同位素一小段單鏈DNA作為探針對克隆基因文庫進行雜交，互補結(jié)合需要基因片段，依據(jù)放射性同位素在膠片上感光原理，能夠找到目標基因。這個方法通常稱為印跡法。

工作量很大（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫，從中調(diào)用目標基因。（假如不知道目標基因核酸次序）基因工程醫(yī)學知識講座第13頁印跡法內(nèi)切酶切開DNA電泳印跡轉(zhuǎn)移放射性探針雜交膠片顯影基因工程醫(yī)學知識講座第14頁印跡法主要步驟：

（1）基因文庫－DNA用限制性內(nèi)切酶處理。

（2）DNA片斷混合物經(jīng)過電泳分離。

（3）電泳后，經(jīng)過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰纖維薄膜上，方便操作。

（4）用已知小片斷DNA作為探針，互補結(jié)合需要找基因片斷。

（5）探針DNA片斷已用放射性元素標識，使膠片感光后可看出?；蚬こ提t(yī)學知識講座第15頁

印跡法關(guān)鍵是“分子雜交”，利用堿基配正確標準，用一段小已知DNA片斷去尋找大未知基因片斷。

探針DNA片斷從何而來？

依據(jù)目標蛋白氨基酸序列，只要其中N端15－20個氨基酸序列，按三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)為40-60核苷酸序列，人工合成，即為探針DNA片斷?；蚬こ提t(yī)學知識講座第16頁（2）逆轉(zhuǎn)錄合成法（假如所需要DNA片段很?。┮訰NA為模版，逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA片段。先將細胞核內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄為RNA，以信使RNA（mRNA）為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下依據(jù)堿基互補標準人工合成一段與之互補DNA片段，再以此單鏈DNA為模版，人工合成另外一條互補DNA子鏈，從而取得所需目標基因。mRNA→單鏈DNA→

雙鏈DNA（cDNA）

DNA合成儀基因工程醫(yī)學知識講座第17頁（3）聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）（如目標基因核酸次序已知）聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是多年來開發(fā)出來基因工程新技術(shù)，它最大優(yōu)點是把目標基因?qū)ふ液蛿U增，放在一個步驟里完成。反應(yīng)在特制PCR儀中進行，需要DNA模版、引物、TaqDNA聚合酶、四種脫氧核苷酸。

PCR擴增儀基因工程醫(yī)學知識講座第18頁基因克隆是指經(jīng)過重組基因操作，把目標基因連接到載體上，在宿主細胞中增值，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)轉(zhuǎn)移和重新組合。

克隆——生物分子，細胞,生物個體無性繁殖與復(fù)制過程都稱為克隆。PCR反應(yīng)分三步完成：

第一步——變性（DNA解鏈），在95℃高溫下，使作為模版雙鏈DNA片斷因變性而解鏈成單鏈DNA。第二步——退火（引物與單鏈DNA結(jié)合），將溫度降至55℃下，個別引物DNA與模版單鏈DNA特定互補部位相互配對結(jié)合。

第三步——延伸（分別合成互補鏈），將溫度回升到72℃下，由DNA高溫聚合酶催化，以目標基因為模版，使合成新鏈延伸，形成互補DNA雙鏈，取得所需要目標基因。

基因工程醫(yī)學知識講座第19頁2、結(jié)構(gòu)重組DNA分子

以質(zhì)粒作載體為例用與提取目標基因相同限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目標基因插入切口處，讓目標基因黏性末端與切口上黏性末端互補配對后，在連接酶作用下連接形成一個環(huán)形重組DNA分子。提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目標基因和質(zhì)粒連接基因工程醫(yī)學知識講座第20頁目標基因與質(zhì)粒連接基因工程醫(yī)學知識講座第21頁3、將目標基因?qū)胧荏w細胞并擴增基因工程中常見受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動植物細胞等。轉(zhuǎn)化是指外源DNA分子或片段被細菌細胞吸收，并整合進細胞染色體遺傳現(xiàn)象，若受體細胞是動/植物細胞，通常稱為轉(zhuǎn)染。導入受體細胞常見方法是借鑒細菌或者病毒侵染細胞路徑。通常還要對一些受體細胞進行增大通透性處理。（氯化鈣或高壓電脈沖打孔）目標基因能夠伴隨受體細胞進行快速繁殖，在很短時間內(nèi)取得大量基因。將目標基因?qū)胧荏w細胞將受體細胞進行擴增基因工程醫(yī)學知識講座第22頁4、目標基因檢測（1）克隆基因凝膠電泳檢測

將克隆了目標基因重組質(zhì)粒從受體細胞中分離出來，選擇適當限制性內(nèi)切酶對其進行酶解，采取凝膠電泳法檢測酶解片段。

凝膠電泳法是用于分離、純化、判定DNA片段常見方法，DNA片段上磷酸基團都帶有負電荷，當不一樣長度DNA片段裝入瓊脂糖凝膠一端后，DNA分子便向陽極運動，不一樣長度DNA片段就會表現(xiàn)出不一樣遷移速率，可依據(jù)DNA分子大小來使其分離，經(jīng)過分子質(zhì)量標準參考物和示蹤染料與樣品一起電泳而得到檢測。

基因工程醫(yī)學知識講座第23頁

（2）Southern雜交對于外源目標基因在轉(zhuǎn)基因生物中情況檢測好可采取放射性同位素標識核酸雜交法進行檢測，也稱為該法是利用毛細管作用使在凝膠電泳中分離DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當濾膜上，然后經(jīng)過與已用同位素標識單鏈DNA探針雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移DNA片段?；蚬こ提t(yī)學知識講座第24頁（3）核苷酸測序法（自動檢測分析）。

已知目標基因核苷酸序列可利用序列測定進行判定。該方法是一個使用熒光染料無放射性標識DNA測序法。它使用4種不一樣顏色熒光染料分別標識4種不一樣堿基，并在一個凝膠電泳泳道中進行電泳，然后經(jīng)過激光作用誘發(fā)熒光，到達檢測堿基目標。激光檢測器招搜集到信息傳到電腦，計算機會自動顯示或打印出堿基次序。一塊凝膠36個泳道可測36×450約16200個堿基。以后又創(chuàng)造了一個用毛細管電泳代替凝膠電泳方法，可大大加緊電泳速度分辨率，并可實現(xiàn)自動灌膠和自動進樣?；蚬こ提t(yī)學知識講座第25頁四、基因工程應(yīng)用

基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

1、微生物基因工程（1）在制藥方面

生產(chǎn)新抗生素，提升產(chǎn)量基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到蛋白質(zhì)－肽類藥品?；蚬こ提t(yī)學知識講座第26頁重組人胰島素1982年世界第1個轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素將與產(chǎn)人胰島素相關(guān)兩個基因片段（人工合成）轉(zhuǎn)入大腸桿菌重組干擾素1200升人血1升發(fā)酵液（重組大腸桿菌）2－3萬美元/病人200－300美元/病人基因工程醫(yī)學知識講座第27頁（2）生產(chǎn)生物小分子

生產(chǎn)維生素C替換合成法。

提升氨基酸產(chǎn)量（將一些基因轉(zhuǎn)入高產(chǎn)菌中）

（3）生產(chǎn)生物多聚體

生產(chǎn)黃原膠、生物合成橡膠、生產(chǎn)生物可降解塑料基因工程醫(yī)學知識講座第28頁（4）在生物農(nóng)藥上應(yīng)用

經(jīng)過基因改造大規(guī)模生產(chǎn)微生物殺蟲劑、生物除草劑。

（5）在環(huán)境工程中應(yīng)用

美國GE企業(yè)結(jié)構(gòu)成功含有巨大烴類分解能力基因工程菌，并獲專利，用于去除石油污染?；蚬こ提t(yī)學知識講座第29頁（6）轉(zhuǎn)基因植物

抗病蟲基因、抗除草劑基因、抗旱基因、抗病基因、抗寒基因、一些動物蛋白基因。

當前世界上大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因作物有：

水稻、大豆、馬鈴薯、玉米、番茄、煙草、棉花、油菜、甜菜、向日葵、豌豆、辣椒、苜蓿、蘋果、梨、蘭花、玫瑰、康乃馨

在植物轉(zhuǎn)基因中多采取農(nóng)桿菌作為目標基因受體，再利用重組農(nóng)桿菌感染植物細胞進行轉(zhuǎn)化，將目標基因整合到植物基因中?；蚬こ提t(yī)學知識講座第30頁（7）轉(zhuǎn)基因動物

轉(zhuǎn)基因動物主要用于生產(chǎn)器官移植研究，生產(chǎn)對人類有價值產(chǎn)品，使動物含有一些可遺傳抗性對付一些疾病與不良環(huán)境，當前出于對安全性考慮，禁止將轉(zhuǎn)基因動物進入食品。

當前將人一些基因轉(zhuǎn)入動物，生產(chǎn)一些蛋白類藥品已經(jīng)廣泛實施。普通動物轉(zhuǎn)基因多采取受精卵注射法，將目標基因直接注射入動物受精卵中，有一個別生產(chǎn)出動物細胞內(nèi)含有這些目標基因。還有胚胎干細胞法，將目標基因轉(zhuǎn)化胚胎干細胞，再進行胚發(fā)育，一旦成為生殖細胞，可取得穩(wěn)定遺傳?；蚬こ提t(yī)學知識講座第31頁轉(zhuǎn)基因食品

伴隨轉(zhuǎn)基因作物普及，當前世界已經(jīng)有很多食品中含有轉(zhuǎn)基因成份，如食用油、土豆泥、番茄醬、豆制品，海關(guān)檢測表明60%進口食品中含有轉(zhuǎn)基因成份。

轉(zhuǎn)基因食品安全性

當前世界上還未發(fā)覺轉(zhuǎn)基因食品對人類健康危害，不過安全性依然需要長久監(jiān)測。

各國制訂了相關(guān)法規(guī)，中國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標志管理方法》（包含大豆、玉米、油菜、番茄及其加工產(chǎn)品）基因工程醫(yī)學知識講座第32頁五、基因和人類基因組計劃(HGP)人類基因組計劃產(chǎn)生背景人類基因組計劃意義圖譜繪制僅是第一步基因研究是把雙刃劍視頻基因工程醫(yī)學知識講座第33頁二、人類基因組計劃產(chǎn)生背景

當代自然科學發(fā)展使人類成為地球上主宰，但人類對本身認識和保護卻不盡如人意。全球約有20%-50%人天天備受各種慢性疾病折磨；我國11%人患有高血壓；4.2%人有不一樣程度殘疾；2.5%人智力低下；腫瘤、心血管疾病等主要死因已成為驅(qū)除不掉幽靈；艾滋病、瘋牛病等新傳染病使大家對未知災(zāi)難又有了新恐懼。人類對人體本身奧秘知之甚少，有鑒于此，研究人類基因組，揭示人類基因奧秘，認識人類遺傳信息并進而了解人類各種疾病與基因相互關(guān)系，從而到達從根本上預(yù)防人類疾病發(fā)生以及有效根治疾病?；蚬こ提t(yī)學知識講座第34頁何為基因組計劃？

假如把人類基因組比喻為一本有10億單詞百科全書,這本書可分為23章，每章為一個染色體。而每一個染色體上又包含數(shù)千個被稱為基因“小說”。這些小說由一系列3字母單詞組成，其中每個單詞是4個基礎(chǔ)化學即字母即：G，C，A，T這4種堿基任意排列組合。人類基因組計劃正是要讀出這30億個堿基，也就是測出人體全部染色體30億堿基正確排列次序?；蚬こ提t(yī)學知識講座第35頁

最早提出HGP這一構(gòu)想是美國生物學家、諾貝爾獎得主Dulbecco。他在1986年3月7日出版Science雜志上發(fā)表了一篇題為“腫瘤研究一個轉(zhuǎn)折點：人類基因組全序列分析”短文，提出包含癌癥在內(nèi)人類疾病發(fā)生都與基因直接或間接相關(guān)，呼吁科學家們聯(lián)合起來，從整體上研究人類基因組，分析基因序列。這一倡議爭論了兩年，美國國會于1990年同意了這一項目，計劃耗資30億美元，完成?；蚬こ提t(yī)學知識講座第36頁

人類基因組計劃任務(wù)與意義

人類基因組計劃主要任務(wù)是：找出人體約10萬個基因，確定30億個堿基正確排列次序，進行數(shù)據(jù)分析，認識人類遺傳信息。其意義在于揭示人類基因奧秘，并進而了解人類各種疾病與基因相互關(guān)系，從而到達從根本上預(yù)防人類疾病發(fā)生以及有效根治疾病，生命現(xiàn)象將在分子水平得到解釋。

1990年，國際人類基因組計劃正式開啟，美、日、德、法、英等國參加，1999年，中國也加入了，負責1%工作。年6月26日，人類有史以來第一個基因組草圖終于完成了。

基因工程醫(yī)學知識講座第37頁●有史以來最大科學成就●人類生命科學里程碑,生命科學“登月計劃”，其意義不亞于人類登上月球“阿波羅計劃”。26日公布工作草圖中包含人體90%以上堿基正確位置信息，這足以幫助科學家掌握人類生命密碼主要框架結(jié)構(gòu)?；蚬こ提t(yī)學知識講座第38頁基因革命，未來讓大家看到詳細結(jié)果人類基因組研究所所長柯林斯認為，圖譜最大用途是能夠用于醫(yī)療診療。今后醫(yī)生能夠把病灶告訴有遺傳傾向人，讓他們設(shè)法避開日后發(fā)病危險。美國國家人類基因組研究所對未來25年做了預(yù)測：

2-3年內(nèi)繪制出覆蓋率為100%序列圖，同時制訂相關(guān)法律；

-年，對癌癥、糖尿病等疾病將出現(xiàn)相關(guān)基因檢測試驗，對血友病將出現(xiàn)臨床基因治療方法；

年，將研究出適應(yīng)個人基因組合治療方法，可治療包含癌癥在內(nèi)很多疾??；

2025年，醫(yī)生將有能力修復(fù)基因缺點，一些如貧血之類先天性疾病從此將成為歷史。到2050年,許多病癥將會在癥發(fā)前就被毀滅?；蚬こ提t(yī)學知識講座第39頁

人類還有5000各種遺傳病以及與遺傳親密相關(guān)各種病患要賴于基因治療。這其中包含最常見腫瘤、糖尿病、貧血、高血壓、精神病等?；蚪M計劃給了咱們一個光明未來：搞清人類各種疾病根源，破解生命全部奧秘。未來，修改或替換致病基因應(yīng)該不是夢想。許多疾病將從地球上消失。眼前例子是，色盲基因前很快已經(jīng)被找到。人類能夠依據(jù)“基因圖”調(diào)整自己生活方式，使自己處于最正確生命環(huán)境中，延長壽命。

科學家把人基因組中執(zhí)掌胖瘦基因也找出來了。未來胖子減肥和瘦子增胖都將是很輕易事情?；蚬こ提t(yī)學知識講座第40頁工作草圖是國際合作結(jié)果

6個國家16個中心上千名科學家參加。其中，美國占54%，英國占33%，日本占7%，法國占2.8%，德國占2.2%，中國占1%。每個國家所占份額同該國生物產(chǎn)業(yè)水平成正比。人類基因組計劃精神，即百慕大標準：全部試驗室或中心都應(yīng)該把長度在1000個以上堿基對片段在24小時內(nèi)遞交給公共數(shù)據(jù)庫。全球科學家、產(chǎn)業(yè)界等可完全無償享用?；蚬こ提t(yī)學知識講座第41頁中國科學家做了什么？

1999年5月，中國加入這一研究計劃，負責測定3號染色體上三千萬個堿基對，中國所以成為參加這一研究計劃唯一發(fā)展中國家。中國科學家僅用六個月時間就完成所負擔任務(wù)。

中國現(xiàn)在測序能力排名第四，在美、英、日之后，在德、法之前。華大基因研究中心測序能力在參加人類基因組計劃全世界16個試驗室中，排名第七。中國今年五月份從美國引進了三十多臺世界上最先進基因測序儀?；蚬こ提t(yī)學知識講座第42頁是否參加“計劃”討論連續(xù)了十年兩種意見：△大多數(shù)科學家主張把有限基金投入到基因組下游工程——生物基因開發(fā)上。這是建立在上游工程——基因測序當選據(jù)公開、結(jié)果共享基礎(chǔ)上。假如全部基因圖譜都向外國買，中國買不起。21世紀兩大支柱產(chǎn)業(yè)——信息產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)已被外國掌握，咱們只能以市場以代價換技術(shù)。在21世紀，咱們健康需要人類基因組計劃，咱們醫(yī)藥工業(yè)需要它，咱們農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)都需要它?；蚬こ提t(yī)學知識講座第43頁△對蝦病毒事例

90年代中期我國對蝦受病毒侵害,造成慘重損失。為了對付這種病毒，需要對病毒基因組進行測定。然而當初中國沒有這種能力做，只好委托外國企業(yè)做。這個工作量只相當于這次1%1%，只需花30萬元，而讓他人來做花掉180萬元不說，還要出讓1/3知識產(chǎn)權(quán)。1998年8月，中科院遺傳所“人類基因中心”掛牌，第二年2月，中心決心搞基因組測序，創(chuàng)造加入國際人類基因組計劃條件?；蚬こ提t(yī)學知識講座第44頁※基因保護

比爾.蓋茨說，第二個“比爾.蓋茨”將出現(xiàn)在基因領(lǐng)域，為此他看好