核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)演示文稿

核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)演示文稿目前一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)目前二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)基本原理目前三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸，簡稱RNA；和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。DNA是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，RNA在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用，其中轉(zhuǎn)移核糖核酸，簡稱tRNA，起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，簡稱mRNA，是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖體的核糖核酸，簡稱rRNA，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。目前四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸的結(jié)構(gòu)與特征核酸的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：核苷酸以3’，5’磷酸二酯鍵構(gòu)成無分支結(jié)構(gòu)的線性分子二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)或局部雙鏈三級結(jié)構(gòu)：超螺旋結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)：DNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物目前五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核算的結(jié)構(gòu)與特征核酸的特性核酸的變性作用爆發(fā)式Tm值核酸的復(fù)性作用驟然冷卻緩慢冷卻目前六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸的雜交在適宜的條件下，將不同來源的DNA放在試管里，經(jīng)熱變形后，慢慢冷卻，讓其復(fù)性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則可以通過互補(bǔ)堿基多之間非共價鍵（氫鍵）的作用，形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，即復(fù)性形成雜交DNA探針（probe）：利用標(biāo)記分子對其它分子的識別性而實(shí)現(xiàn)對后者進(jìn)行檢測的一種技術(shù)，通常把標(biāo)記的分子叫探針探針技術(shù)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合目前七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核算雜交的方法固相雜交固相支持物應(yīng)具備的特征：1、具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力2、與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過程而不至于脫落或脫落很少4、非特異性吸附少，在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉5、具有良好的機(jī)械性能固相雜交類型：Southern印記、Northern印記、組織原位雜交、菌落原位雜交等液相雜交目前九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸探針的制備目前十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)概述核酸探針以研究和診斷為目的，用來檢測特定序列核算的DNA或RNA片段。目前十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸探針的種類DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)核酸探針的標(biāo)記和檢測放射性標(biāo)記

32P和35S切口移位法隨機(jī)引物延伸標(biāo)記法末端標(biāo)記法125I標(biāo)記RNA和DNA非放射性標(biāo)記

生物素、洋地黃毒苷配體-dUTP、辣根過氧化物、堿化基團(tuán)半抗原、熒光素、化學(xué)發(fā)光劑、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法DNA探針的吖啶酯標(biāo)記目前十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southern印跡雜交目前十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)概述Southernblotting將待測核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上，即印跡固定于膜上的核酸同標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火（復(fù)性），即分子雜交過程目前十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting待測核算樣品的制備與限制酶消化采集樣本、提取DNA基因組DNA很長，通常用限制性酶消化目前十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品目的：按片斷長短進(jìn)行分離，確定雜交靶分子的大小瓊脂糖凝膠濃度的選擇電泳，EB染色，紫外燈觀察凝膠目前十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting電泳凝膠的預(yù)處理為了使DNA片段在合理的時間內(nèi)從凝膠中移動出來，必須將最長的DNA片段控制在大約2kb一下0.25mol/LHCl短暫脫嘌呤，堿液浸泡，使DNA變性病斷裂形成較短的單鏈DNA片段，用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液，然后在20×SSC中平衡凝膠10min目前十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting轉(zhuǎn)膜常用固相支持物：NC膜和Nylon膜常用轉(zhuǎn)膜方法：細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等目前十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting探針標(biāo)記預(yù)雜交與Southern雜交將膜上所能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉，即預(yù)雜交的目的；預(yù)雜交后雜交2×SSC淋洗膜后置于合適的容器中并加入10ml左右的預(yù)雜交溶液，65℃轉(zhuǎn)動或搖動3-4h；煮沸探針5-10min使其變性，立即加入65℃預(yù)熱的雜交液；倒去預(yù)雜交液并加完成的雜交液，65℃轉(zhuǎn)動或搖動過夜目前二十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting洗膜采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交的關(guān)鍵一步放射性自顯影檢測X線底片曝光與洗片目前二十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Southernblotting注意事項(xiàng)目前二十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Northern雜交技術(shù)目前二十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理：

Northern雜交是利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)。其基本原理和程序與Southern雜交類似，基本過程包括RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳分離，將變性的RNA從凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移，然后與濾膜結(jié)合，最后用標(biāo)記探針對固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交，用放射自顯影等方法顯示與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)的目的條帶。目前二十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

由于RNA極易降解，而RNA酶不僅無處不在，而且很難消除，所以在操作過程中必須采取必要的措施，包括使用專門準(zhǔn)備的用具、試劑和溶液等，所有溶液盡量用DEPC處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水制備。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操作人員必須戴防護(hù)手套。目前二十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟：

1、進(jìn)行RNA瓊脂糖凝膠電泳

2、RNA變性

3、將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上

4、使RNA與尼龍膜結(jié)合

5、RNA與探針雜交

6、洗去非結(jié)合探針

7、放射自顯影顯示與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)的目的條帶目前二十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

變性：由于RNA直接與尼龍膜結(jié)合力差，且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，必須將RNA先經(jīng)變性劑（甲醛/羥甲基汞/戊二醛）處理，一方面使RNA變性，另一方面可促進(jìn)RNA與濾膜有效結(jié)合。注意：RNA變性與DNA變性方法不同，不能用堿變性，否則易引起RNA水解。目前二十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

轉(zhuǎn)移：用刀片修飾凝膠，棄去不需要部分和加樣孔以上部分，并在一角切成三角形缺口以做記號。剪取一張略大的尼龍膜，一角剪成與凝膠缺口同樣大小的三角形缺口，將膜漂浮在一盤去離子水表面，待完全侵濕后在10倍SSC中侵泡至少5min。轉(zhuǎn)膜有兩種方法：電轉(zhuǎn)移法和毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法目前二十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法圖示：目前二十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

電轉(zhuǎn)移法圖示：目前三十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

取出尼龍膜，甩掉多余液體，將有RNA的一面朝上，在濾紙上晾幾分鐘。將尼龍膜晾干后，夾在兩濾紙之間，在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。目前三十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)雜交將放射性同位素標(biāo)記的DNA探針經(jīng)100℃煮沸5min和冰浴2min變性，然后將探針和膜放入袋中雜交，在68℃水浴中雜交過夜。

目前三十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

雜交結(jié)束后，將尼龍膜在一定量的0.1%SDS-1倍SSC中室溫下輕輕搖動洗滌10min，然后在一定量的預(yù)熱至68℃的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗滌3次。

目前三十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

注意事項(xiàng)：

1、EB會影響RNA與尼龍膜的結(jié)合，所以在膠中不能加核酸染料EB。

2、實(shí)驗(yàn)所用的器具、試劑以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境一定要防止RNase的污染。

3、所有用于Noethern印跡的溶液均需用DEPC處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水制備。

4、操作人員必須戴防護(hù)手套和口罩，防止RNase污染和操作人員吸入DEPC中毒。目前三十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)目前三十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)基因擴(kuò)增（geneamplification)——

指生物體內(nèi)或體外基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。PCR擴(kuò)增：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法?；驍U(kuò)增技術(shù)---PCR目前三十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)DNA的復(fù)制（1）3’-OH進(jìn)攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’目前三十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)DNA的復(fù)制（2）DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在復(fù)制起始點(diǎn)打開雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結(jié)合到單鏈DNA上進(jìn)一步解開雙鏈DNA目前三十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)DNA的復(fù)制（3）目前三十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR技術(shù)的創(chuàng)建

KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。目前四十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)故事發(fā)生在1983年

的春夏之交目前四十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一目前四十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA……目前四十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)Mullis的第一個PCR實(shí)驗(yàn)

1983年9月中旬，

Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。目前四十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)94℃55℃37℃目前四十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)基本原理PCR是一種體外酶促合成特異DNA片段的新方法它由一對引物介導(dǎo)，與模板DNA特異結(jié)合，選擇性地?cái)U(kuò)增特異的DNA片段反應(yīng)體系包括：DNA靶序列、引物、四種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱DNA聚合酶、合適的緩沖液體系目前四十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR技術(shù)的三步反應(yīng)目前四十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)--變性目前四十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)--變性目前四十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)--變性目前五十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)—退火目前五十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)—延伸目前五十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)—延伸目前五十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)—延伸目前五十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR循環(huán)—延伸目前五十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR整個過程目前五十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前五十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃目前五十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物目前五十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶目前六十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)

第1輪結(jié)束第2輪開始95℃目前六十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃TaqTaqTaqTaq目前六十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第2輪結(jié)束目前六十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增目前六十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的技術(shù)路線目前六十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本步驟體系（加樣方法）

10×PCR緩沖液10ulDNA模板0.1-1ugdNTP（2mmol/L）各10ul

兩種引物（10-50umol/L）各1-2ulddH2O（滅菌）加至100ul

離心15s，加石蠟?zāi)壳傲揬總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的基本步驟PCR循環(huán)預(yù)變性97℃，2-5min，迅速冷卻至室溫加入TaqDNA聚合酶主循環(huán)變性94℃30-60s

退火55℃30-60s

延伸72℃60-150s

循環(huán)25-35次終延伸72℃5-10min目前六十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前六十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系及其優(yōu)化目前六十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)概述模板引物緩沖體系一價或二價陽離子四種dNTP耐熱DNA聚合酶目前七十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)模板模板的純化模板DNA片段大小適宜的模板量目前七十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)引物

引物：決定PCR反應(yīng)的特異性

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增目前七十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)

基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的原則目前七十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)引物引物的長度引物的擴(kuò)增跨度引物的組成引物3‘端配對引物的濃度目前七十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)①引物長度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段目前七十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯誤延伸④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)

—特別避免3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶目前七十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前七十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴(kuò)增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響

目前七十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)⑦引物的特異性：—引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會目前七十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)技術(shù)舉例目前八十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十二頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十三頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十四頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十五頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十六頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十七頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十八頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)目前八十九頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)耐熱DNA聚合酶目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少目前九十頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的功能TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶的使用量TaqDNA聚合酶的影響因素目前九十一頁\總數(shù)九十九頁\編于十四點(diǎn)三磷酸脫氧核苷酸在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200μM，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的