酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)第1頁/共33頁實驗一酶聯(lián)免疫吸附試驗（驗證性實驗）第2頁/共33頁實驗?zāi)康?/p>

驗證酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理掌握雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法的基本原理掌握酶聯(lián)免疫試劑盒的基本組成熟悉酶聯(lián)免疫操作方法第3頁/共33頁實驗內(nèi)容簡介酶聯(lián)免疫吸附試驗是最常用的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)，有四種基本類型：夾心法（雙抗體夾心和雙抗原夾心）、間接法、競爭法、捕獲法。本實驗以雙抗體夾心法測定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）為例，驗證酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理。第4頁/共33頁實驗原理

雙抗體夾心法篩選兩種抗-HBsAg（針對不同抗原表位），一種連接于固相載體制備酶標反應(yīng)板；另一種標記過氧化物酶制備酶標抗體。測定時，待測抗原分別與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體雙抗體夾心復(fù)合物。第5頁/共33頁實驗材料

ELISA試劑盒預(yù)包被抗體酶標反應(yīng)板系列標準品抗原酶標抗體（抗HBsAg-HRPO）質(zhì)控血清顯色底物終止液濃縮洗液第6頁/共33頁實驗方法

制備酶標板包被封閉

實驗準備標本編號所有試劑平衡至室溫稀釋洗液第7頁/共33頁實驗方法

操作步驟加標準品或待測樣本，37℃溫浴30min；洗滌3~5次，加酶標記抗體；37℃溫浴30min；洗滌3-5次，加顯色液A和顯色液B；室溫15min，再加入終止液;讀取A450nm第8頁/共33頁

繪制標準曲線采用Logistic曲線擬合劑量反應(yīng)曲線結(jié)果判斷第9頁/共33頁

準確使用微量加樣器所有試劑需平衡至室溫加入試劑或標本后需輕輕振蕩洗滌過程要標準化注意事項第10頁/共33頁實驗討論

問題:

HBsAg定量分析的臨床意義？酶聯(lián)免疫吸附試驗的注意事項？如何檢測抗-HBsAg？天津醫(yī)科大學李會強第11頁/共33頁實驗二酶免疫組織化學染色技術(shù)（驗證性實驗）第12頁/共33頁實驗?zāi)康尿炞C酶免疫組織化學技術(shù)的原理掌握PAP-酶免組化法的檢測原理熟悉PAP-酶免組化技術(shù)操作要領(lǐng)第13頁/共33頁實驗內(nèi)容簡介酶免疫組織化學技術(shù)集抗原抗體結(jié)合的特異性、酶免疫分析的敏感性和組織化學技術(shù)的直觀性特點為一體，常用于細胞鑒定、抗原定位、病理組織觀察等方面。本實驗以辣根過氧化物-抗辣根過氧化物免疫組化技術(shù)檢測成熟CD3+T細胞為例，對這一技術(shù)的原理和操作流程進行驗證。第14頁/共33頁實驗原理

要點：特異性抗體識別抗原PAP復(fù)合物的放大效應(yīng)橋聯(lián)抗體連接作用第15頁/共33頁實驗材料一抗（識別抗體）：抗CD3抗體

PAP復(fù)合物：過氧化物酶抗-過氧化物酶二抗（橋聯(lián)抗體）：兔抗鼠Ig第16頁/共33頁實驗方法

分離外周血單個核細胞采用密度梯度離心法分離

制片

免疫反應(yīng)加一抗，37℃60min洗滌玻片3次同時加橋聯(lián)抗體和PAP復(fù)合物，37℃30min洗滌玻片3次加底物顯色鏡檢第17頁/共33頁注意事項

制片時，細胞均勻，密度適中免疫反應(yīng)過程中，洗滌充分濕盒中反應(yīng)，防止干片鏡檢時，注意區(qū)分特異和非特異第18頁/共33頁結(jié)果分析

采用高倍鏡觀察計數(shù)。將待檢載破片置普通光學顯微鏡下觀察，陽性細胞呈棕黃色，計數(shù)200個細胞，計算CD3+細胞的百分比。第19頁/共33頁實驗討論

思考題：酶免疫組織化學技術(shù)的影響因素有哪些？在酶免疫組織化學技術(shù)中，為何不直接將酶蛋白標記在抗體分子上？酶免疫組織化學技術(shù)有何優(yōu)點？天津醫(yī)科大學李會強第20頁/共33頁實驗三

酶聯(lián)免疫試劑盒的研制（設(shè)計性實驗）第21頁/共33頁實驗?zāi)康?/p>

熟悉酶聯(lián)免疫試劑盒研制要點抗原純化與抗體制備制備酶標記抗原（或抗體）方法選擇與設(shè)計篩選抗體（抗體匹配）優(yōu)化反應(yīng)條件第22頁/共33頁實驗相關(guān)知識簡介

理論知識酶聯(lián)免疫吸附試驗

相關(guān)技術(shù)蛋白純化酶標記化合物制備酶標反應(yīng)板制備第23頁/共33頁實驗要求題目：假設(shè)需采用酶聯(lián)免疫法測定某種腫瘤標志物，設(shè)計實驗如何制備酶聯(lián)免疫試劑盒？要求：設(shè)計實驗方案，繪制技術(shù)路線圖說明重要實驗內(nèi)容和實驗方法第24頁/共33頁實施策略

重要環(huán)節(jié)：純化抗原和制備抗體方法學選擇與設(shè)計抗原抗體選擇抗體匹配（雙抗體夾心法）確定工作濃度優(yōu)化反應(yīng)條件第25頁/共33頁總結(jié)與討論

問題：研制酶聯(lián)免疫試劑盒需做哪些準備工作？如何根據(jù)待測物質(zhì)特性選擇合適反應(yīng)類型？雙抗體夾心法如何進行抗體匹配實驗？理想劑量反應(yīng)曲線應(yīng)具備哪些條件？天津醫(yī)科大學李會強第26頁/共33頁實驗四定量酶免疫分析中標準曲線的數(shù)學模型（設(shè)計性實驗）第27頁/共33頁實驗?zāi)康?/p>

掌握常用標準曲線數(shù)學模型

線性回歸法logistic曲線擬合

第28頁/共33頁實驗相關(guān)知識簡介

理論知識基本變量分析物濃度和信號強度免疫分析的特殊性待測物濃度影響反應(yīng)速率曲線擬合方式影響測定結(jié)果第29頁/共33頁實驗要求題目：根據(jù)所給數(shù)據(jù)，繪制標準曲線或得出數(shù)學模型。CEA濃度（ng/ml）0102050100200400A值0.0540.3300.4560.7791.2311.7262.397第30頁/共33頁實施策略

兩種方式擬合四參數(shù)Logistic曲線擬合

Logit-