第二章色譜法概論

第二章色譜法概論第1頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特（VanDeemter）總結(jié)了前人的經(jīng)驗(yàn)，提出了反映載氣流速和柱效關(guān)系的范第姆特方程式，建立了初步的色譜理論。

我國(guó)科技工作者，早在1956年就開展了氣相色譜法的研究工作，1958年，我國(guó)的第一臺(tái)氣相色譜儀研制成功。

第2頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.色譜法分類

不管屬于哪一類色譜法，其共同的基本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：不動(dòng)的一相，稱一為固定相；另一相是攜帶樣品流過(guò)固定相的流動(dòng)體，稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。第3頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一.按兩相狀態(tài)分類

氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GC），根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）．液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）。同理，液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）．超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFC）.。通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）.

第4頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二．按分離機(jī)理分類

利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術(shù)，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離。第5頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。

根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于下表中。

三．按固定相的外形分類第6頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第7頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語(yǔ)

一．流出曲線和色譜峰

第8頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線的線性范圍內(nèi)，色譜峰如果對(duì)稱，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：

式中C：不同時(shí)間t時(shí)某物質(zhì)的濃度，C0：進(jìn)樣濃度，tr：保留時(shí)間，σ：標(biāo)準(zhǔn)偏差。第9頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、基線(baseline)

是柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖中O—t線．穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。

三、峰高(peakheight)

色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖中B′A。第10頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、保留值(retentionvalue)

1．死時(shí)間tM(deadtime)

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，如圖中O′A′。因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近．測(cè)定流動(dòng)相平均線速ū時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算。第11頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2．保留時(shí)間tR（retentiontime)

試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖中O′B．它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間。第12頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3．調(diào)整保留時(shí)間tR’（adjustedretentiontime)

某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保留時(shí)間，即：

tR′=tR-tM

4．死體積VM(deadvolume)

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和．當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0（L／min）計(jì)算：

VM=tM·F0

第13頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5．保留體積VR(retentionvolume)

指從進(jìn)樣開始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間tR的關(guān)系如下：

VR=tR·F0

6．調(diào)整保留體積VR’(adjustedretentionvolume)

某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積，即:

VR′=VR-VM第14頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

7．相對(duì)保留值γ2.1(relativeretentionvalue)

某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值：

由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)．

必須注意，相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比.第15頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三8.選擇因子(Selectivefactor)

在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)(s),然后再求其它峰(i)對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值。此時(shí)，ri/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號(hào)α表示：

式中tR2′為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)α總是大于1的。第16頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五、區(qū)域?qū)挾?peakwidth)

色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素．度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：

1.標(biāo)準(zhǔn)偏差σ(standarddeviation)

即0．607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖中EF距離的一半。

2.半峰寬W1/2(peakwidthathalf-height)

即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖中GH間的距離．它與標(biāo)準(zhǔn)偏差σ的關(guān)系是：W1/2=2.354σ第17頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3.基線寬度W(peakwidthatpeakbase)

即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如圖中IJ的距離．它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是：

W=4σW≈1.7W1/2

第18頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三從色譜流出曲線上可以得到許多重要信息：

（l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個(gè)數(shù)．（2）根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析．(3)根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析．（4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)．（5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)．第19頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

基于物質(zhì)在兩相間具有不同的分配系數(shù)。當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，試樣中的各組分就在兩相中進(jìn)行反復(fù)多次分配，使得原來(lái)的分配系數(shù)差異不大的各組分產(chǎn)生很大的分離效果，從而實(shí)現(xiàn)各組分的分離開來(lái)。色譜法分析的基本原理第20頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、分配系數(shù)K和分配比k

1．分配系數(shù)K

如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配過(guò)程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次地吸附一脫附過(guò)程。這種分離過(guò)程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來(lái)描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)。分配系數(shù)指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即：第21頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.分配比k

分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即

第22頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

k值越大，說(shuō)明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。

式中CS，Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度；Vm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。第23頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三滯留因子Rs分配比k值可直接從色譜圖測(cè)得。設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度為u，組分在柱內(nèi)線速度為us，由于固定相對(duì)組分有保留作用，所以u(píng)s＜u．此兩速度之比稱為滯留因子Rs。第24頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Rs若用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，即

對(duì)組分和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的色譜柱，其所需時(shí)間分別為:第25頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三整理可得:

第26頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系

其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對(duì)填充柱，其β值一般為6～35；對(duì)毛細(xì)管柱，其β值為60～600。

第27頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子α的關(guān)系

根據(jù)前面的推導(dǎo)，對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：

通過(guò)選擇因子α把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來(lái)，α對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說(shuō)明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。第28頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、塔板理論

最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。第29頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三該理論假定：

（i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。（ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（ΔVm）。（iii）所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。為簡(jiǎn)單起見，設(shè)色譜柱由5塊塔板（n＝5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2…，n－l；某組分的分配比k=1.第30頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

根據(jù)上述假定，在色譜分離過(guò)程中，該組分的分布可計(jì)算如下：開始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當(dāng)一個(gè)板體積（lΔV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相（或固相）中ns部分組分及1號(hào)板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總量為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25而1號(hào)板上所含總量同樣為0.5．氣液（或氣固）相亦各為0.25。以后每當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過(guò)程就重復(fù)一次(見下表)。第31頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

第32頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

按上述分配過(guò)程，對(duì)于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動(dòng)進(jìn)入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣液兩相中的總質(zhì)量）見表。

由塔板理論可建流出曲線方程：

m為組分質(zhì)量，Vr為保留體積，n為理論塔板數(shù)。當(dāng)V=Vr