第三章高效液相色譜分析

第三章高效液相色譜分析第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三3.1高效液相色譜分析法的特點1.高壓采用高壓泵使流動液能迅速通過色譜柱，一般達150×105～350×105Pa。2.高速高壓帶來高速，分析時間一般少于lh。3.高效柱效能約可達3萬塔板/米（GC的柱效約為2000/米）。4.高靈敏度由于采用了高靈敏度的檢測器，最小檢測量可達10-9g，甚至10-11g。5.可用于高沸點的、不能氣化的、熱不穩(wěn)定的以及具有生理活性物質(zhì)的分析

一、高效液相色譜法第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三二、HPLC與GC差別

1．分析對象的區(qū)別

GC：

適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品；但對高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測。(占有機物的20%)

HPLC：

適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛。（占有機物的80%）第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2．流動相的區(qū)別GC：流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余地廣，改變流動相極性和pH值也對分離起到調(diào)控作用，當選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。3．操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三三、HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC1.環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)影響色譜峰擴展及色譜分離的因素影響分離的主要因素有流動相的流量、性質(zhì)和極性。

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三（1）流速：流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三(2)

液體的粘度比氣體大一百倍,密度為氣體的一千倍,故降低傳質(zhì)阻力是LC中提高柱效的主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫

改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三1．分離原理：利用組分分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異

分離前提：K不等或k不等一、液固吸附色譜法（LSC）

流動相為液體，固定相為固體吸附劑第三節(jié)HPLC分離類型與原理第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2．固定相<>分為極性和非極性兩類<>極性固定相：硅膠、氧化鋁和氧化鎂、硅酸鎂分子篩等，其中極性硅膠應(yīng)用最普遍。<>非極性固定相：多孔微?；钚蕴?、多孔石墨化炭黑，以及高分子多孔微球等。第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三1）硅膠：

<>無定型硅膠最早使用，傳質(zhì)慢、柱效低<>薄殼型硅膠直徑為30~40μm的玻璃珠表面涂布一層1~2μm

厚的硅膠微粒，孔徑均一、滲透性好、傳質(zhì)快，但柱容量有限。<>全多孔球型硅膠粒度一般為5~10μm，顆粒和孔徑的均一性都比前兩種好，柱容量大，為當今液固色譜固定相的主體，也是鍵合固定相的主要基質(zhì)。原理-吸附特點-峰易拖尾適用-分離極性化合物第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2）高分子多孔小球：特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三3．流動相

除了最基本的要求之外，主要考慮溶劑強度，溶解度參數(shù)及極性參數(shù)等。第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三1．分離原理：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點是固定液層的耐溶劑沖刷性能差，固定液易流失，從而導(dǎo)致柱效降低，被鍵合相填料所取代。3．正相色譜-固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，適于分離極性組分。

反相色譜-固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分。二、液液分配色譜法（LLC）第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

鍵合相色譜基本上屬于分配色譜，與液液分配色譜固定相不同的是“固定液”以化學鍵的形式與載體結(jié)合在一起的。

常規(guī)化學鍵合相利用化學反應(yīng)將固定液的官能團鍵合在載體表面

1．分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）

2．特點：不易流失熱穩(wěn)定性好化學性能好載樣量大適于梯度洗脫4.化學鍵合相色譜（CPC）第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三三、離子色譜法（IC）1.離子交換色譜

凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可以用離子交換色譜法進行分離，其主要根據(jù)固定相對待測離子對的親和力的差異來實現(xiàn)分離。固定相類型：強陽離子交換劑（如磺酸基）強陰離子交換劑（如季胺基）弱陽離子交換劑（如羧基）弱陰離子交換劑（如氨基）流動相以水相緩沖液為主，有時加少量有機改性劑。第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

離子色譜是在20世紀70年代中期發(fā)展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。2.離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三3.離子對色譜離子對色譜是一種分離離子型化合物的特殊分離模式。采用非極性固定相分離弱酸或弱堿等可離子化的物質(zhì)時，因其在固定相上的保留作用很弱，不易分離。故在流動相中加一種與被分析物極性相反的離子（離子對試劑），使其與被分析物形成締合物，從而增加保留，提高分離度。第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三四、排阻色譜色譜size-exclusionchromatography固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三五、親和色譜(AC)Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三六、分離類型選擇

choiceofseparationtypes第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)高效液相色譜儀器第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三一、流程（processofHPLC）首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三二、主要部件（mainassemblyofHPLC）

4（6）個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)；

脫氣裝置；梯度洗脫；進樣系統(tǒng)；分離系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)；

此外還配有自動進樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三儀器組成高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三溶劑貯液瓶用途：貯存流動相溶劑材料：玻璃或塑料，無色或棕色，容積：約為0.5～2.0L位置：高于泵，以保一定的輸液靜壓差。1.高壓輸液系統(tǒng)第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三高壓輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三輸液泵應(yīng)具備的性能①流量穩(wěn)定。對定性定量的準確性至關(guān)重要。②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型能達到100ml/min。③輸出壓力高，一般可高達400~500kg/cm2。④液缸容積小，適于梯度洗脫。⑤密封性好，耐腐蝕。第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三輸液泵類型1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動放大泵目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三泵的使用與維護防止任何固體微粒進入泵體，因此應(yīng)過濾流動相。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)停泵過夜或保留在泵內(nèi)更長時間。必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于保存色譜柱和有利于泵維護的溶劑。防止流動相耗盡空泵運轉(zhuǎn)，導(dǎo)致柱塞磨損、缸體或密封損壞，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力不能超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液(40MPa,400bar,5800psi)。流動相應(yīng)脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三2.脫氣裝置流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進入色譜柱,排出這些氣泡則很費時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三目前，液相色譜流動相脫氣使用較多的是：①離線超聲波振蕩脫氣；②在線惰性氣體（氦氣）鼓泡吹掃脫氣；③在線真空脫氣。真空脫氣裝置：將流動相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮氣、單流路真空脫氣裝置的原理二氧化碳就會從膜內(nèi)進入膜外而被脫除。一般真空脫氣裝置有多條流路，可同時對多個溶液進行脫氣。第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三3.梯度洗脫裝置在進行多成分的復(fù)雜樣品的分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。

HPLC的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。

①線性梯度;②階梯梯度高壓梯度低壓梯度第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三高壓梯度裝置結(jié)構(gòu)優(yōu)點：只要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實現(xiàn)自動化控制。缺點：使用了兩臺高壓輸液泵，使儀器價格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實現(xiàn)二元梯度操作。第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三四元低壓梯度系統(tǒng)結(jié)構(gòu)只需一個高壓泵，混合就在泵前安裝了一個比例閥中完成。因比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合易形成氣泡，常配置在線脫氣裝置，來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后進入比例閥，混合后從一根輸出管進入泵體。第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三4.進樣系統(tǒng)作用：將試樣引入色譜柱位置：在高壓泵和色譜柱之間類型：手動或自動進樣器：六通閥第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三進樣器

手動經(jīng)注射器進樣自動六通閥圓盤式自動進樣器鏈式自動進樣器第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三六通閥手動進樣器原理示意圖LoadInject第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三手動進樣器用微量注射器將樣品溶液注入六通閥注意必須使用HPLC專用平頭微量注射器，不能使用氣相色譜尖頭微量注射器，否則會損壞六通閥。進樣方式：有部分裝液法和完全裝液法第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三自動進樣器由計算機自動控制進樣六通閥、計量泵和進樣針的位置，按預(yù)先編制的進樣操作程序工作，自動完成定量取樣、洗針、進樣、復(fù)位等過程。第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三5.分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三柱溫箱用于使色譜柱恒溫的裝置，一般其控溫范圍高于室溫，也可低于室溫，通?？刂浦鶞卦?0～40℃。有些柱溫箱還具有柱切換裝置。色譜柱的工作溫度對保留時間、相對保留時間、溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般升高柱溫，可增加組分在流動相中的溶解度，減小分配系數(shù)K，縮短分析時間；還可降低流動相的黏度，降低柱壓與提高柱效。第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三6．檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。第52頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三

1）紫外-可見吸收檢測器UV-Vis：適用于吸收紫外或可見光的物質(zhì)靈敏度較高，應(yīng)用范圍較廣

(光電二極管陣列檢測器DAD)2）熒光檢測器FLD：只能分析具有熒光活性的物質(zhì)靈敏度高，但適用范圍有限

3）示差折光檢測器RID：利用折光率的差別來檢測，為通用型檢測器，但靈敏度低，溫度要求嚴格第53頁，共57頁，2023年，2月20日，星期三4）電化學檢測器：常用的有電導(dǎo)檢測器和安培檢測器電導(dǎo)檢測器是測量物質(zhì)在流動相中電離后所引起的電導(dǎo)率的變化，組分濃度越高，電離產(chǎn)生的離子濃度越高，電導(dǎo)率變化就越大，多用于離子色譜。安培檢測器適用于測定所有在工作電極的電壓范圍內(nèi)發(fā)生氧化或還原反應(yīng)的物質(zhì)，