實驗二醋酸纖維素薄膜電泳

山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校《生物化學(xué)》實驗教案教研室生物化學(xué)課程生物化學(xué)實驗專業(yè)09級所有專業(yè)指導(dǎo)教師徐燕教材生物化學(xué)實驗指導(dǎo)內(nèi)容實驗一醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)學(xué)時2教學(xué)要求學(xué)的要教目和求1.掌握醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)2.測定血清中各種蛋白質(zhì)的相對含量教學(xué)重點難點重點：醋酸纖維素薄膜分離血清蛋白質(zhì)的方法難點：電泳的基本原理和主要影響因素教學(xué)媒體學(xué)生動手操作為主，課堂演示為輔復(fù)習(xí)舊課蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)教學(xué)過程講授新課原理乙酸纖維素薄膜電泳是以乙酸纖維素薄膜作為支持體的一種電泳方法。本實驗將其用于分離血清蛋白質(zhì)。方法是將少量新鮮血清用點樣器點在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6,血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中帶有負(fù)電荷，在電場中移向正極，血清中不同蛋白質(zhì)由于帶有電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快，帶電荷少及分子量大者泳運速度慢。經(jīng)過一定的時間后，取消電薄取出，立即將其浸入氨基黑10B染色液中，使蛋白質(zhì)固定并染色。隨后將薄膜移入浸洗液中，洗至背景無色為止+此時薄膜上顯示出藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動快慢順序，各區(qū)帶分別為清蛋白、al-球蛋白、a2-球蛋白、0-球蛋白和Y-球蛋白。乙酸纖維素薄膜由于對樣品沒有吸附現(xiàn)象，電泳時各區(qū)帶分界清楚，拖尾現(xiàn)象不明顯，樣品用量少，以及電泳時間短等，已被廣泛應(yīng)用。試劑和器材1.試劑新鮮血清(無溶血現(xiàn)象)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6)稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于少量蒸餾水后定容1000ml。漂洗液取95%乙醇45ml，冰醋酸5ml和蒸餾水50ml，混勻。

（4）洗脫液0.4mol/NaOH。2.器材電泳儀、電泳槽、乙酸纖維素薄膜、蓋玻片、濾紙、剪刀（三）操作方法乙酸纖維素薄膜的潤濕和選擇講授新課將2.0cmx8.0cm薄膜放入緩沖液中浸泡10min,整條薄膜顏色一致而無白色斑點，則表明薄膜質(zhì)地均勻（講授新課制作電橋?qū)捅韧拙彌_液倒入電泳槽內(nèi)，用乳膠管連通兩槽，使兩槽緩沖液平衡至同一水平面。取去乳膠管，于兩電極槽各放入四層濾紙或紗布，一端浸入緩沖液中，另一端貼附在電泳槽支架上，它們的作用是聯(lián)系薄膜與兩極緩沖液之間的中間“橋梁”。點樣與電泳取出浸透的薄膜，平放在濾紙上（無光面向上），輕輕吸去多余的緩沖液。用點樣器蘸取血清，“印”在薄膜的點樣區(qū)，點樣區(qū)要呈粗細(xì)均勻一直線。將點好樣的薄膜兩端緊貼在電泳槽支架的濾紙橋上，點樣端置負(fù)極，平衡10min，接通電源，調(diào)節(jié)電流為0.4?0.6mA（薄膜每厘米寬），電壓為每厘米長10—12V，電泳45--60min。染色與浸洗電泳完畢后，切斷電源，將薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，15min后取出。然后用漂洗液浸洗3遍，每次約10min，直至背景無色為止。結(jié)果判斷一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、al-球蛋白、a2-球蛋白、0-球蛋白和Y-球蛋白。（四）注意事項乙酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點樣。點樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。緩沖溶液離子強度不應(yīng)小于0.05或大于0.07。因為這小可使區(qū)帶拖尾，過大則使區(qū)帶過于緊密。

講授新課電泳槽中緩沖液要保持清潔（數(shù)天過濾一次），兩極溶液要交替使用，最好將連接正、負(fù)極的線路調(diào)換使用。通電過程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。課堂提問醋酸纖維素薄膜電泳的原理及優(yōu)點課堂小節(jié)根據(jù)血清中蛋白質(zhì)各組分等電點，如何估計它們在