實驗六蠶豆根尖微核檢測技術(shù)(學(xué)時)綜合性設(shè)計性

二、實驗原理微核簡稱(MCN)，是真核生物細胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。在細胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應(yīng)在主核1／3以下。微核的折光率及細胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實驗也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細胞分裂末期被兩個子細胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經(jīng)證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。目前一頁\總數(shù)二十六頁\編于十點由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們需要有一套高度靈敏、技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進行微核測試與以動物進行的一致率可達99%以上。目前微核測試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護、化學(xué)誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。利用蠶豆根尖作為實驗材料進行微核測試，可準確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測。目前二頁\總數(shù)二十六頁\編于十點三、實驗材料松滋青皮豆（蠶豆）種子四、實驗器具、藥品試劑實驗器具：顯微鏡，計數(shù)器，鑷子，載玻片，蓋玻片，燒杯，瓷盤等。實驗藥品：6mol/L鹽酸，甲醇，冰乙酸，醋酸洋紅，EMS(甲基磺酸乙酯)處理液：150,200mmol/L2種處理濃度。NaN3(疊氮鈉)處理液：0.5,1.0,1.5mmol/L3種濃度。CrO3：1.0，2.5mol/L2種處理濃度污水：目前三頁\總數(shù)二十六頁\編于十點五、實驗方法1．實驗材料的培育蠶豆根尖細胞的染色體大，DNA含量高，因而對誘變因子反應(yīng)敏感。松滋青皮豆是從不同蠶豆品種中篩選出來的一種較為敏感的品種。本品種引入后在栽培繁殖時要注意不要同其它蠶豆品種種在一起，不噴灑農(nóng)藥、以保持該品種較低的本底微核值。也可用其它蠶豆品種，但是必須設(shè)置對照組。種子成熟后，曬干貯藏于干燥器內(nèi)或4℃冰箱內(nèi)備用。

目前四頁\總數(shù)二十六頁\編于十點2．浸種催芽：將實驗用蠶豆種子按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25℃下浸泡24小時，此間至少換水兩次．所換水應(yīng)25℃預(yù)溫。種子吸脹后；用紗布松散包裹置白磁盤中，保持濕度，在25℃溫箱中催芽12－24小時，待初生根長出2—3mm時，再取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的磁盤中，25℃繼續(xù)催芽，經(jīng)約36～48小時．大部分初生根長至1～2cm左右，根毛發(fā)育良好，這時即可用來進行檢測了。目前五頁\總數(shù)二十六頁\編于十點3．處理每一處理選取6-8粒初生根生長良好、根長一致的種子，放入盛有待測物溶液的培養(yǎng)皿中，浸沒根尖。陽性因子可采用CrO3（1.0和2.5mol/L）、NaN3（0.5、1.0和1.5mol/L）或EMS（150和200mol/L），另取一處污水作待檢測物質(zhì)，用自來水作對照，共9個處理，處理根尖6～24h(處理時間可視實驗需要和被測液濃度而定)。目前六頁\總數(shù)二十六頁\編于十點4．根尖細胞恢復(fù)培養(yǎng)將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2－3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙或脫脂棉的白磁盤內(nèi)25℃溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)22－24小時。5．固定根尖細胞及制片(參考根尖壓片法)(1)將恢復(fù)培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端，切下1cm長的幼根。用卡諾氏液固定24h，固定后如果不及時制片，可換入70%的乙醇中，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。目前七頁\總數(shù)二十六頁\編于十點6．酸解：從70％乙醇中取出固定好的根尖→流水沖洗３min→吸水紙吸干→放入盛有適量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保溫的青霉素瓶中→解離10min。7．染色

改良石炭酸品紅染色：解離后材料水洗3min并吸干，挑取1個根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴染液，染色10～15min，壓片。目前八頁\總數(shù)二十六頁\編于十點8．壓片

在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。目前九頁\總數(shù)二十六頁\編于十點9．鏡檢及微核識別標準首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。微核識別標準：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數(shù)1000個細胞中的微核數(shù)并進行記錄。目前十頁\總數(shù)二十六頁\編于十點目前十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十點六、實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和污染程度劃分將實驗數(shù)據(jù)按以下步驟進行統(tǒng)計學(xué)分析處理：1．計算各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MCN‰）如果對照本底MCN‰為10‰以下，可采用如下標準進行分析以確定樣品的污染程度：

MCN‰在10‰以下，表示基本沒有污染；

MCN‰在10‰－18‰?yún)^(qū)間，則表示有輕度污染；

MCN‰在18‰－30‰?yún)^(qū)間，則表示有中度污染；

MCN‰在30‰以上，則表示有重度污染；

目前十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十點也可以采用“污染指數(shù)”判別：此方法可避免因?qū)嶒灄l件等因素帶來的MCN‰本底的波動，方法如下：

污染指數(shù)在0－1.5區(qū)間為基本沒有污染；

污染指數(shù)在1.5－2區(qū)間為輕度污染；

污染指數(shù)在2－3.5區(qū)間為中度污染；

污染指數(shù)在3.5以上為重度污染；如果對照本底MCN‰為10‰以上，可采用t檢驗（被測樣品較少時）檢測處理液致畸效果是否明顯，或以F檢驗（被測樣品較多時）檢測各處理之間是否具有顯著的差異。目前十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十點七、注意事項：1.各種誘發(fā)微核的處理試劑具有一定毒性，請注意使用安全，并防止污染環(huán)境。2.凡數(shù)值在上下限時，定為上一級污染。3.對嚴重污染的水環(huán)境進行檢測時，檢測處理會造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再作測試；4.在沒有空調(diào)恒溫設(shè)備時，如室溫超過30℃，MCN本底可能有升高現(xiàn)象，但可經(jīng)污染指數(shù)法數(shù)據(jù)處理，不會影響檢測結(jié)果。目前十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十點蠶豆根尖微核檢測記錄表試驗號鏡檢日期鏡檢者片號第一片第二片第三片各自觀察的細胞數(shù)或微核數(shù)細胞數(shù)微核數(shù)細胞數(shù)微核數(shù)細胞數(shù)微核數(shù)總計平均微核千分率目前十五頁\總數(shù)二十六頁\編于十點目前十六頁\總數(shù)二十六頁\編于十點目前十七頁\總數(shù)二十六頁\編于十點目前十八頁\總數(shù)二十六頁\