8反相層析課件

反相層析Reversedphasechromatography,RPC江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院反相層析概述原理反相層析介質(zhì)反相層析的流動(dòng)相層析技術(shù)應(yīng)用1概述反相層析法的建立追述到1950年，Howard和Martin用正辛烷作為固定相，水作為流動(dòng)相進(jìn)行石蠟油的液-液層析分離，并且把這種方法命名為反相層析所謂“正相”或“反相”，主要是指固定相和流動(dòng)相的相對(duì)極性大小，反相層析因與傳統(tǒng)分配層析剛好相反而得名，其固定相非極性強(qiáng)而流動(dòng)相極性相對(duì)較高，樣品中組分被洗脫的順序是極性較高的組分先流出，極性較低的后被洗脫反相層析流動(dòng)相的溶劑洗脫強(qiáng)度變化范圍大，使溶質(zhì)保留值的差別可以達(dá)到1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，因此反相層析可分離的溶質(zhì)范圍很寬，從極性較大的寡肽、小分子有機(jī)物到疏水性較強(qiáng)的生物大分子反相層析能夠區(qū)分分子在疏水性質(zhì)方面的細(xì)微差異而有效地進(jìn)行分離，具備高分辨率的特性2原理2.1反相層析作用原理疏溶劑理論（solvophobictheory） 反相層析機(jī)理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏溶劑理論，假設(shè)反相層析介質(zhì)是表面均勻密集的覆蓋著非極性配基的顆粒，溶質(zhì)分子由于受到極性流動(dòng)相的斥力而以其疏水部分結(jié)合至固定相的非極性配基上，除此之外溶質(zhì)與固定相之間不存在其他任何相互作用親硅醇基效應(yīng)（silanophilicinteraction）

一定條件下硅膠表面殘余的硅醇基能與溶質(zhì)發(fā)生相互作用，包括：靜電作用和氫鍵作用，從而對(duì)溶質(zhì)的保留行為起決定作用;親硅醇基效應(yīng)常導(dǎo)致溶質(zhì)保留值重復(fù)性差，洗脫峰脫尾等不良層析行為控制流動(dòng)相pH，硅膠表面均勻覆蓋非極性配基，屏蔽殘余硅醇基，可基本排除親硅醇基效應(yīng)的影響;新型反相層析介質(zhì)聚苯乙烯等高分子聚合材料的開發(fā)可根本消除親硅醇基效應(yīng)的影響。2.2反相層析的分離過程起始階段：用具有合適pH、I和極性的流動(dòng)相A平衡反相層析柱吸附樣品：加樣至層析柱，洗去未結(jié)合的溶質(zhì)開始解吸：通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相極性等方式將反相介質(zhì)上吸附的溶質(zhì)順序解吸完全解吸：移除前一步未解吸的物質(zhì)再生：介質(zhì)從100%流動(dòng)相B重新過渡到流動(dòng)相A3反相層析介質(zhì)3.1介質(zhì)的構(gòu)成基質(zhì)：硅膠、聚苯乙烯等配基：正烷烴基團(tuán)（n-烷基），常用的有辛基（C-8）和十八烷基（C-18），其他還包括丙基、丁基、丙基苯基、二苯基等3.1.1基質(zhì)硅膠優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度高，能承受高壓、高流速，理化穩(wěn)定性好，多孔性結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：高pH條件下會(huì)溶解，并且會(huì)產(chǎn)生負(fù)電荷，對(duì)分離造成不良影響，只能在酸性條件下使用SiOHSiSiO聚苯乙烯在強(qiáng)酸強(qiáng)堿性條件下穩(wěn)定性好，不產(chǎn)生親硅醇基效應(yīng)3.1.2配基正烷烴基n-辛基n-十八烷基n-丙基二苯基等3.1.3配基與基質(zhì)的偶聯(lián)用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅膠表面殘留的硅醇基配基較大時(shí)，由于空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致親硅醇基效應(yīng)存在3.2反相層析介質(zhì)的性質(zhì)粒徑RPC是與HPLC技術(shù)伴隨發(fā)展的，有著高分辨率，反相介質(zhì)的粒徑一般在5~30μm之間，小于常用的凝膠過濾介質(zhì)和離子交換劑，有著較高的柱效分析型應(yīng)用：<15μm介質(zhì)制備型應(yīng)用：>15μm介質(zhì)孔徑通常在10～50nm之間，孔徑的大小直接影響到有效結(jié)合容量，10nm左右孔徑的介質(zhì)分離小分子物質(zhì)，孔徑在30nm以上的介質(zhì)分離生物大分子配基密度通常情況下反相介質(zhì)有著較高的配基密度當(dāng)配基鏈長(zhǎng)超過C6時(shí)，配基密度在同一數(shù)量級(jí)時(shí)對(duì)相對(duì)保留值的影響很小結(jié)合容量每毫升反相介質(zhì)能結(jié)合溶質(zhì)的毫克數(shù)（mg溶質(zhì)/mL介質(zhì)），分為靜態(tài)結(jié)合容量和動(dòng)態(tài)結(jié)合容量結(jié)合容量取決于溶質(zhì)的分子大小、疏水性，介質(zhì)的多孔性、配基密度，流動(dòng)相的組成、pH，操作流速等機(jī)械強(qiáng)度用最大操作壓力（MPa）或最大線性流速（cm/h）表示穩(wěn)定的理化性質(zhì)3.3常見的反相層析介質(zhì)3.3.1SOURCETMRPC系列基于聚苯乙烯的反相介質(zhì)，用于肽、蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸等的分析型和制備型分離純化，能夠在高流速條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速、可重復(fù)、高容量和高分辨率分離根據(jù)介質(zhì)的粒徑不同，該系列包括SOURCE5RPC、SOURCE15RPC和SOURCE30RPC三個(gè)規(guī)格SOURCERPC系列介質(zhì)的主要特性SOURCERPC良好的重復(fù)性優(yōu)秀的放大能力優(yōu)秀的流速/壓力特性3.3.2μRPCC2/C18系列是以粒徑為3μm的多孔硅膠微粒為基質(zhì)，鍵合二碳和十八碳的烷烴基團(tuán)形成的反相介質(zhì)具有非常小的粒徑，具有很高的效率和優(yōu)秀的分辨率，十分適合于用于肽譜分析，分析型和極微量純化過程。以預(yù)裝柱形式出售，有兩種不同的規(guī)格μRPCC2/C18PC3.2/30μRPCC2/C18PC2.1/100μRPCC2/C18反相層析柱的特性3.3.3SephasilProtein/SephasilPeptide系列以多孔硅膠作為基質(zhì)的，提供兩種不同的粒徑，分別是5μm和12μm，前者適用于高分辨率分析和純化，后者適用于制備型純化有三種不同配基，分別為C4，C8和C18，其疏水性依次增強(qiáng)SephasilProtein孔徑較大，為30nm，允許蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入，因而適用于蛋白質(zhì)的分離純化；SephasilPeptide孔徑較小，在10nm左右，更適合于較小的生物分子如肽類等的分離純化Sephasil系列預(yù)裝柱的特性4反相層析的流動(dòng)相流動(dòng)相組成影響層析過程的容量因子和選擇性，從而很大程度決定著Rs由多種成分組成的，其中包含水、一至兩種的有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH的緩沖組分（酸）、調(diào)節(jié)溶質(zhì)選擇性的離子對(duì)試劑等，有時(shí)還需其它種類的添加劑分為流動(dòng)相A（起始流動(dòng)相）和流動(dòng)相B（極限流動(dòng)相），一般線性過渡4.1有機(jī)溶劑又稱為修飾劑（modifier），其作用是降低流動(dòng)相極性，增強(qiáng)洗脫能力流動(dòng)相A為水相或者有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)較低的溶劑-水混合相，而流動(dòng)相B則是有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)較高的溶劑-水混合相甚至不含水的純有機(jī)相要求是能夠與水互溶，有較低的紫外截止波長(zhǎng)和較低的粘度截止波長(zhǎng)：此波長(zhǎng)下光程為1cm的純?nèi)軇┑奈舛葹?反相層析中常用有機(jī)溶劑的部分性質(zhì)有機(jī)溶劑的種類直接關(guān)系到對(duì)樣品組分的選擇性，因此在分離效果不理想時(shí)，可以對(duì)溶劑的使用進(jìn)行優(yōu)化反相層析的流動(dòng)相大多采用二元系統(tǒng)，即由水和一種有機(jī)溶劑組成洗脫能力：甲醇<乙醇<乙腈<1-丙醇<2-丙醇根據(jù)分離實(shí)際需要，也可采用兩種甚至兩種以上的修飾劑構(gòu)成三元、四元的流動(dòng)相系統(tǒng)，以期獲得合適的洗脫強(qiáng)度和最佳的選擇性在分離多肽和蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)當(dāng)慎用多元流動(dòng)相，這是因?yàn)閺?fù)雜的溶劑體系會(huì)導(dǎo)致多肽和蛋白質(zhì)的沉淀和變性4.2流動(dòng)相的pH控制流動(dòng)相pH的改變會(huì)影響到溶質(zhì)的解離狀態(tài)、固定相表面殘留硅醇基和其它吸附基團(tuán)的解離情況、以及添加至流動(dòng)相的可解離組分的離子平衡，因此pH值的改變會(huì)引起溶質(zhì)選擇性和保留值的改變酸性條件常用三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）和正磷酸調(diào)節(jié)pH，接近中性時(shí)常用乙酸銨或磷酸鹽來調(diào)節(jié)pH，堿性條件用NaOH來調(diào)節(jié)控制在（a）pH2和（b）pH12條件下分離血管緊張肽Ⅱ和血管緊張肽Ⅲ

反相層析流動(dòng)相條件大多在低pH下（通常pH2～4之間），因?yàn)椋汉芏鄻悠方M分在低pH下有較好的溶解性低的pH值抑制了樣品組分中酸性基團(tuán)及硅膠上硅醇基的解離由于目前還不明確的原因，多數(shù)蛋白質(zhì)和肽類在低于其等電點(diǎn)的pH條件下操作可以獲得更高的選擇性在低pH時(shí)可采用低的離子強(qiáng)度，這樣更易于回收樣品4.3離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑也稱為平衡離子，是通過離子作用與溶質(zhì)分子結(jié)合，引起溶質(zhì)疏水性質(zhì)的改變，從而使得樣品組分的保留值和選擇性發(fā)生變化離子對(duì)試劑中很多本身就是酸或堿，可同時(shí)起維持流動(dòng)相pH的作用，典型的使用濃度范圍是0.01%~0.1%或10~100mmol/L離子對(duì)試劑在高濃度有機(jī)溶劑中要有足夠的溶解度，對(duì)波長(zhǎng)220nm以上的紫外線不能有明顯吸收在某些情況下，離子對(duì)試劑是溶質(zhì)結(jié)合至反相介質(zhì)所必需的4.4其它種類的添加劑Brij：十二烷基聚氧乙烯醚5層析技術(shù)反相介質(zhì)和層析柱的選擇流動(dòng)相的選擇和準(zhǔn)備樣品的準(zhǔn)備和加樣操作洗脫模式的選擇和層析條件控制樣品的檢測(cè)和收集層析柱的再生、清洗和貯存5.1反相介質(zhì)和層析柱的選擇5.1.1層析介質(zhì)的選擇選擇依據(jù)：根據(jù)分離要求，包括規(guī)模和流動(dòng)相條件樣品組分的分子量和尺寸樣品組分的疏水性樣品組分的種類根據(jù)分離要求分辨率－介質(zhì)的選擇性（基質(zhì)、配基種類）和柱效（介質(zhì)粒徑和層析柱的填充）純化規(guī)模－流速性能和結(jié)合容量（粒徑）流動(dòng)相條件－介質(zhì)的穩(wěn)定性（基質(zhì)）樣品組分的分子量結(jié)合容量－粒徑和孔徑樣品組分的疏水性對(duì)樣品中目標(biāo)組分的疏水性強(qiáng)弱有個(gè)大致評(píng)估：疏水性弱的溶質(zhì)，如氨基酸、寡聚核苷酸等，選用疏水性強(qiáng)的配基，如C18（十八烷基）；疏水性較強(qiáng)的溶質(zhì)，選用疏水性較弱的配基，如C8（辛基）以下碳鏈的配基樣品組分的種類生物大分子雖然大多是親水性，但穩(wěn)定性較差，建議采用配基較短（C8以下）的介質(zhì)5.1.2層析柱尺寸的選擇 層析柱的尺寸由內(nèi)徑和柱長(zhǎng)所界定，其取值主要取決于分離的規(guī)模和所需的分辨率內(nèi)徑在柱長(zhǎng)固定的情況下，內(nèi)徑?jīng)Q定了柱體積，RPC在放大層析規(guī)模時(shí)，都是在優(yōu)化好層析條件后，固定柱長(zhǎng)不變，增大層析柱內(nèi)徑來放大加樣量對(duì)Rs的影響柱長(zhǎng)反相介質(zhì)粒徑普遍較小，本身有著較高的柱效，一般所用層析柱柱長(zhǎng)較短對(duì)于寡肽等生物小分子，適當(dāng)增加柱長(zhǎng)能夠改善Rs生物大分子在反相柱中的保留值對(duì)于流動(dòng)相的微小變化十分敏感，可以認(rèn)為是由開/關(guān)機(jī)制控制，增加柱長(zhǎng)不能明顯改善Rs5.1.3層析柱的準(zhǔn)備一般過程：以低速或中等流速用3CV的流動(dòng)相B清洗層析柱以同樣的流速在2~3CV內(nèi)運(yùn)行從100%流動(dòng)相B到100%流動(dòng)相A的線性梯度用至少5CV的流動(dòng)相A平衡層析柱，直至所有信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定5.2流動(dòng)相的選擇和準(zhǔn)備生物分子RPC所用流動(dòng)相常包含一種緩沖組分，一種修飾劑，有時(shí)還含有一種離子對(duì)試劑乙腈和甲醇是最常用的，條件摸索階段以其中一種作為修飾劑，溶質(zhì)在固定相上吸附較為牢固時(shí)，可考慮更換洗脫能力較強(qiáng)的修飾劑如異丙醇等溶質(zhì)分子，特別是蛋白質(zhì)等生物大分子在所用溶劑中的穩(wěn)定性是須考慮的因素分離樣品性質(zhì)不明的情況下，一般流動(dòng)相A為水相，不含修飾劑，而流動(dòng)相B為100%有機(jī)相反相層析多數(shù)在低pH條件下運(yùn)行，流動(dòng)相的pH通過添加一定濃度的酸來調(diào)節(jié)；往流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑可以改變?nèi)苜|(zhì)的保留值和選擇性，獲得較好的分離效果；對(duì)于帶正電荷的溶質(zhì)應(yīng)選擇帶負(fù)電荷的離子對(duì)試劑，如三氟乙酸等，對(duì)于帶負(fù)電荷的溶質(zhì)則應(yīng)選用帶正電荷的離子對(duì)試劑，如季銨鹽等準(zhǔn)備流動(dòng)相時(shí)，所用到的各種試劑都應(yīng)當(dāng)是最高純度級(jí)別的，所用的水也應(yīng)是超純水，添加了固體的流動(dòng)相應(yīng)當(dāng)用0.22μm的濾膜過濾5.3樣品的準(zhǔn)備和加樣操作理想情況下應(yīng)將樣品溶于流動(dòng)相A后加樣，如樣品在流動(dòng)相A中溶解不好，可考慮添加有機(jī)酸、鹽類等試劑來增加樣品的溶解性，液體樣品體積較小時(shí)可直接加樣；樣品在加樣前應(yīng)當(dāng)通過10000g離心10min或用0.22μm微孔濾膜過濾除去任何可能存在的顆粒物；對(duì)于組分特別復(fù)雜的樣品，建議先用其它技術(shù)除雜反相層析柱通常是預(yù)裝柱或帶有可調(diào)接頭的自裝柱，連接于HPLC系統(tǒng)，加樣操作按HPLC系統(tǒng)提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行5.4洗脫模式的選擇和層析條件控制在洗脫模式方面，分為階段洗脫和梯度洗脫階段洗脫優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、分離時(shí)間短、流動(dòng)相消耗少，重復(fù)性好梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：分離效果好階段洗脫應(yīng)用于脫鹽及一些較大規(guī)模的分離，對(duì)于需要高Rs的分離，需要用線性梯度洗脫梯度洗脫是采用修飾劑體積分?jǐn)?shù)連續(xù)變化的流動(dòng)相對(duì)吸附樣品進(jìn)行洗脫，梯度的形狀主要分為線性梯度和非線性梯度，其中線性梯度又可分為連續(xù)線性梯度和分段線性梯度連續(xù)線性梯度和分段線性梯度的比較在流速恒定的情況下梯度斜率改變對(duì)分辨率的影響首次層析時(shí)通常采用很寬的線性梯度洗脫以確定目標(biāo)分子的洗脫條件，常用梯度：10~30CV內(nèi)從0%B到100%B根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整洗脫條件，在需要更高Rs的位置降低梯度斜率在Rs已能滿足要求的情況下，不提倡采用過小的斜率，會(huì)造成峰寬增加當(dāng)降低斜率無法達(dá)到Rs要求時(shí)，應(yīng)考慮更換修飾劑、流動(dòng)相pH或添加離子對(duì)試劑來改變選擇性流速的選擇降低流速在一定程度上可以提高柱效，但同時(shí)也會(huì)增加溶質(zhì)的縱向擴(kuò)散大分子RPC的Rs對(duì)流速并不敏感，過低的流速反而會(huì)造成分辨率下降，同時(shí)使分離時(shí)間延長(zhǎng)過高的流速使動(dòng)態(tài)結(jié)合容量下降溫度的選擇在分離一些低分子量物質(zhì)時(shí)，升高溫度能降低流動(dòng)相黏度，增加傳質(zhì)速度，減少區(qū)帶變寬現(xiàn)象，從而提高柱效，對(duì)于改善分辨率是有利的；在分離蛋白質(zhì)等生物大分子時(shí)，通常在常溫下操作，防止目標(biāo)分子活性喪失RPC中固定相和流動(dòng)相對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響及應(yīng)對(duì)策略流動(dòng)相介導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變?cè)摤F(xiàn)象與蛋白滯留在固定相表面的時(shí)間無關(guān)，對(duì)蛋白在不同組成的流動(dòng)相的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，選用對(duì)目標(biāo)蛋白提供最大穩(wěn)定性的溶劑復(fù)合物作為流動(dòng)相固定相的配基或基質(zhì)引起的構(gòu)象改變?cè)摤F(xiàn)象與流動(dòng)相組成無關(guān)，依賴于固定相表面積、孔隙特征、配基密度和洗脫時(shí)間，可采用短柱，陡峭的梯度和無孔型固定相流動(dòng)相組成和固定相共同導(dǎo)致蛋白變性輕微改變層析系統(tǒng)相比或流動(dòng)相組成，或更換其他層析技術(shù)5.5樣品的檢測(cè)和收集最常用的也是紫外檢測(cè)（考慮修飾劑、離子對(duì)試劑等的干擾），此外，熒光檢測(cè)器、視差折光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器也被用于樣品在線檢測(cè)反相層析后收集得到的目標(biāo)組分溶解在含有機(jī)溶劑的洗脫液中，往往在酸性pH條件，當(dāng)分離物質(zhì)是多肽和蛋白質(zhì)時(shí)很容易引起其變性，可將層析后樣品直接收集在具有合適pH的緩沖液中，一方面將pH值調(diào)節(jié)至目標(biāo)分子穩(wěn)定的范圍，另一方面降低了有機(jī)溶劑的濃度，收集完畢再通過凍干等方法除去溶劑5.6層析柱的再生、清洗和貯存再生常用2～5CV的流動(dòng)相B流經(jīng)層析柱移去殘留在層析柱上的物質(zhì)，然后采用連續(xù)線性下降的梯度從流動(dòng)相B過渡至流動(dòng)相A，再用5CV的流動(dòng)相A充分平衡層析柱清洗常運(yùn)行線性梯度從0.1%TFA到0.1%TFA異丙醇，再幾個(gè)CV的0.1%TFA異丙醇溶液，最后運(yùn)行線性梯度從0.1%TFA異丙醇溶液重新回到0.1%TFA水溶液基于硅膠的介質(zhì)常保存在純的甲醇中，基于聚苯乙烯的介質(zhì)常保存在甲醇或20%乙醇中6應(yīng)用6.1用RPC脫鹽屬吸附技術(shù)，容許待脫鹽樣品的體積很大，清洗后的樣品在很小的體積范圍內(nèi)被洗脫，完成脫鹽的同時(shí)實(shí)現(xiàn)樣品的濃縮反相層析脫鹽后，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，所得樣品重新溶解在所需緩沖體系中后可以進(jìn)行下一步操作6.2分析型分離純化RPC最為典型的應(yīng)用是作為高Rs的純化技術(shù)，從復(fù)雜混合物中分離特定產(chǎn)物，如：從蛋白酶水解產(chǎn)物分離特定的肽，從寡核苷酸混合物分離特定的核苷酸這類應(yīng)用一般選用3~15μm粒徑的高效介質(zhì)，并優(yōu)化流動(dòng)相組成、梯度斜率、柱溫等各個(gè)純化細(xì)節(jié)核糖體蛋白質(zhì)的分離純化原核生物核糖體的大亞基為50S，小亞基為30S，每個(gè)亞基都由核糖體RNA和數(shù)十種蛋白質(zhì)組成使用反相層析從E.coli的50S核糖體純化核糖體蛋白質(zhì)，得到13種純度很高的50S核糖體蛋白和23S核糖體RNA，純度達(dá)到氨基酸測(cè)序所需的要求，此外還收集到若干種部分純化的50S核糖體蛋白質(zhì)層析柱為UltraporeRPSC，介質(zhì)的粒徑為5μm，孔徑30nm，配基為十八烷基，層析柱尺寸為4.6×75mm，柱溫為35℃，流速0.5ml/min。流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液，流動(dòng)相B為0