動物毒理學(xué)：第六章 特殊毒性作用

第六章特殊毒性作用本章提綱第一節(jié)致突變作用及其評價

（一）概述——遺傳學(xué)和遺傳毒理學(xué)（二）致突變物的檢測方法第二節(jié)生殖發(fā)育毒性試驗（一）基本概念（二）生殖發(fā)育毒性試驗及評價第三節(jié)致癌試驗第一節(jié)致突變作用及其評價

（一）概述——遺傳學(xué)和遺傳毒理學(xué)

1.基本概念

2.遺傳損傷的類型（二）致突變物的檢測方法

1.細菌回復(fù)突變試驗(Ames)試驗

2.微核試驗

3.小鼠精子畸形試驗

4.顯性致死試驗

5.染色體畸變分析（一）概述1.基本概念遺傳毒理學(xué)(genetictoxicology)

研究化學(xué)物及其他環(huán)境因素對生物體遺傳物質(zhì)的損害作用及其規(guī)律。是建立在100多年的遺傳學(xué)實驗技術(shù)的基礎(chǔ)上；是遺傳學(xué)實驗技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用。遺傳毒理學(xué)的研究意義我們只是人類基因庫的“暫時保管者”。工業(yè)化、化學(xué)合成、電能、核能等科技成果給人類帶來了好處，但也可能改變?nèi)祟惖幕驇?。有?zé)任盡量防止遺傳毒物誘發(fā)新的突變，防止產(chǎn)生新的遺傳病。意義重大和深遠。保護人類基因庫，建立切實可行的檢測方法和檢測系統(tǒng)，制訂合理的防護標(biāo)準(zhǔn)，并盡可能把健康配子的基因組傳給后代。遺傳毒理學(xué)的建立和發(fā)展1969年，誕生1973年，美國加州，國際環(huán)境誘變劑學(xué)會聯(lián)合會（IAEMS）1976-1979年，S9肝微粒體活化系統(tǒng)的建立各種新的檢測篩選技術(shù)的出現(xiàn)基本概念變異(variation)指同一物種的個體間和歷代間的差異。突變(mutation)指遺傳物質(zhì)發(fā)生可遺傳的變異，分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。致突變作用(mutagenesis)指外來因素引起生物體細胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，即突變的發(fā)生及其過程，又稱誘變作用。誘變劑(mutagen)指能引起突變的物質(zhì)，又稱致突變物或遺傳毒物(genotoxicagent)。年事件作者1904發(fā)現(xiàn)X射線可以改變生殖細胞的遺傳物質(zhì)DeVries1927用X射線照射果蠅發(fā)現(xiàn)可以引起基因突變Muller1943發(fā)現(xiàn)芥子氣可誘發(fā)基因和染色體畸變Averbach&Robson1951用X射線可誘發(fā)小鼠突變1966化學(xué)物可誘發(fā)小鼠突變Russed1969成立國際環(huán)境誘變劑學(xué)會Guttanach突變研究簡史例：日本新型食品防腐劑AF21968年，日本上野制藥公司合成出AF2高效殺菌的新型硝基類化合物當(dāng)時稱為：劃時代食品防腐劑通過了大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系病理學(xué)教研室的急、慢性毒性試驗厚生省的批準(zhǔn)，商品化，廣泛應(yīng)用了幾年1973年的9月，第二次日本環(huán)境誘變劑會上，認(rèn)為AF2有遺傳毒性1974年8月證實了具有致癌性，禁止專家：即使禁止使用10年后，日本人的消化器官的癌癥仍將大大增加，子孫的遺傳病也將大大增加保護人類基因庫特別關(guān)心處在生育年齡人群的基因庫。因接觸環(huán)境致突變物迅速提高突變率，會增加基因庫的遺傳負荷，相應(yīng)增加下一代遺傳疾病發(fā)生的危險性。要有長遠觀點：要制訂優(yōu)生優(yōu)育的法規(guī)，加強環(huán)境致突變物的檢測和管理。個人：有良好的自我保護意識。遺傳毒理學(xué)基礎(chǔ)基因(gene)：是DNA分子中最基本的完善的功能單位，是生物遺傳信息的攜帶者，是決定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。體細胞及生殖細胞的特征體細胞遺傳損傷不會傳給后代生殖細胞突變引起可遺傳的遺傳性疾病、先天性畸形及后代的其他異常人類的遺傳病超過4,000種估計：100個新生兒中3-10個患有各種遺傳病包括：

性染色體異常?。喝缣丶{氏綜合征：外貌象女性，個子低，120-140cm，先天性心臟病

常染色體異常?。喝缣剖暇C合征

常染色體顯性遺傳?。喝缍嘀?/p>

常染色體隱性遺傳病：如白化病，先天性聾啞

X伴性隱性遺傳?。喝缂仔脱巡。t綠色盲，進行性肌營養(yǎng)不良

X伴性顯性遺傳?。喝缈咕S生素D佝僂病，10種此方式的遺傳病

多基因遺傳?。喝缣悄虿。哐獕?，腭裂，唇裂等引起高血壓的原因有動物脂肪攝入過多，吸煙，喝酒，精神壓力大等

例：遺傳物質(zhì)損傷與衰老、心血管病細胞衰老的突變學(xué)說：細胞在其代謝生長過程中，不斷產(chǎn)生使DNA發(fā)生突變的物質(zhì)，DNA修復(fù)酶活性降至最低點時就是細胞死亡時。高血壓患者對化學(xué)誘變劑，如2-乙酰氨基芴等引起的DNA損傷比正常血壓的人敏感得多。人類接觸環(huán)境誘變劑會促成動脈粥樣硬化斑塊的形成。2.遺傳損傷的類型堿基置換移碼突變整碼突變片斷改變?nèi)旧w分離異常非整倍體整倍體染色體畸變插入、復(fù)制倒位環(huán)狀、無著絲微環(huán)斷片、缺失、微小體易位輻射體斷裂基因突變遺傳損傷的類型（1）基因突變(genemutation)

又稱點突變(pointmutation)是分子水平的損傷，指基因中DNA序列發(fā)生改變。在光學(xué)顯微鏡下無法見到，一般以生長發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變?yōu)榛A(chǔ)進行檢測?；蛲蛔儯?）——堿基置換堿基替換：指DNA分子中一個堿基被另一個不同的堿基所替換。

轉(zhuǎn)換：嘌呤嘌呤，嘧啶嘧啶

顛換：嘌呤嘧啶

1)同義突變

同義突變(Synonymousmutation)：由于密碼子具有兼并性，單個堿基置換后密碼子所編碼的是同一種氨基酸，表型不改變。正常

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TTA

CGT

AAC

CCG…DNAMetGln

Gln

Gln

Phe

Leu

Arg

AsnPro

同義突變

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TTG

CGT

AAC

CCG…DNA

MetGln

Gln

Gln

Phe

Leu

Arg

AsnPro亮氨酸2)錯義突變

錯義突變(Missensemutation)：DNA分子中的堿基置換后，形成新的密碼子，從而導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，產(chǎn)生活性降低、無活性或無功能的蛋白質(zhì)。正常

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TTA

CGT

AAC

CCG…DNAMetGln

Gln

Gln

Phe

Leu

Arg

AsnPro

錯義突變

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TCA

CGT

AAC

CCG…DNA

MetGln

Gln

Gln

Phe

Ser

Arg

AsnPro絲氨酸3)終止密碼突變

(terminationcodonmutation)當(dāng)DNA分子中的一個終止密碼發(fā)生突變———使多肽鏈的合成繼續(xù)進行下去，一直延長至下一個終止密碼子時停止，產(chǎn)生延長的異常多肽鏈，稱延長突變(elongationmutation)。4)抑制基因突變

(suppressorgenemutation)

Gene內(nèi)部不同位置上的不同堿基發(fā)生了兩次突變，其中一次抑制了另一次突變的遺傳效應(yīng)。

如血紅蛋白病單純?6谷氨酸→纈氨酸，產(chǎn)生Hbs病，致死。同時?6谷氨酸→纈氨酸+?73天冬氨酸→天冬酰胺，產(chǎn)生HbHarlem，臨床癥狀輕，原因是?73突變抑制了?6的突變效應(yīng)。例：視網(wǎng)膜色素變性PRPF31基因突變例：視網(wǎng)膜色素變性PRPF31基因突變盲點例：視網(wǎng)膜色素變性PRPF31基因突變顛換：G突變成TGDF5導(dǎo)致的指（趾）關(guān)節(jié)粘連AlignmentofhumanGDF5,BMP2Green:conserveddisulfidebridgesinallfamilymembers;

Red:typeIreceptor-bindingsite;

Pink:thetypeIIreceptor-bindingregion;

Violet:residuesbindingboththetypeII-receptorandnoggin(NOG).

SuperpositionwiththeBMP2–BRIAcomplexgreen：BMP2dimer;red：BRIAmolecules；

yellow：thecentralGDF5dimer.DifferencebetweenE491KandR438LEK:負電荷到正電荷RL:親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被酔491KperhapsdisruptthebindingofGDF5andNOGEvidence:ThedisabledfunctionofNOGresultedinamassiveoverproductionofcartilageandacompletelossofjointformationinthemouse.Ourhypothesises基因突變（2）——移碼突變移碼突變指發(fā)生一對或幾對（3對除外）的堿基減少或增加，使得從受損點開始堿基序列完全改變。

如減少或增加的堿基對是3對，則基因產(chǎn)物的肽鏈中減少或增加一個氨基酸，后果與堿基置換相似，不包括在移碼突變范疇。

DNA編碼序列中插入（增加）或缺失一個或幾個堿基，其下游閱讀框發(fā)生改變，導(dǎo)致氨基酸順序及蛋白質(zhì)異常或無活性，稱為移碼突變。正常

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TTA

CGT

AAC

CCG…DNAMetGln

Gln

Gln

Phe

Leu

Arg

AsnPro移碼突變（一個堿基缺失)

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TAC

GTA

ACC

CGT…DNA

MetGln

Gln

Gln

Phe

TyrValThr

Argloss1)移碼突變(frameshiftmutation)2)整碼突變(codonmutation)

是指DNA鏈的密碼之間插入或缺失一個或幾個密碼子，導(dǎo)致肽鏈增加了或減少一個或幾個氨基酸，但插入或缺失點以后的氨基酸序列不變，稱整碼突變或稱密碼子插入或缺失。如：AAGGACCCGGCG-------正常密碼子順序

AAGGACAAACCGGCG------插入

AAGGACGCG-----缺失例：導(dǎo)致耳聾的GJB2基因突變例：導(dǎo)致耳聾的GJB2基因突變先證者：235堿基處純合缺失C；其母：（表型正常但攜帶致病基因）則含雜合缺失235堿基C。基因突變（3）——動態(tài)突變動態(tài)突變：鄰近基因或位于基因序列中的三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù),在一代代傳遞過程中會發(fā)生明顯的增加，如(CGG)n、(CAG)n等，從而使（導(dǎo)致）某些遺傳病的發(fā)病。該突變可遺傳并產(chǎn)生表型效應(yīng)——引起疾病,多為神經(jīng)系統(tǒng)疾病。代表疾?。篐utington舞蹈病(CAG)n、強直性肌營養(yǎng)不良，脆性X綜合征(CCG)n。正常

AGT

CAG

CAG

CAG

TTT

TTA

CGT

AAC

CCG…DNAMetGln

Gln

Gln

Phe

Leu

Arg

AsnProAAs動態(tài)突變（CAG三核苷酸重復(fù)）

AGT

CAG

CAG

CAG

CAG

CAG

CAG

CAG

CAG

…DNA

MetGln

Gln

Gln

Gln

Gln

Gln

Gln

Gln

AAs

動態(tài)突變正常人：n=6~50多態(tài)受累個體：n>50copies多者幾百~1000copies隨著世代傳遞長度增加，發(fā)病年齡提前，病情加重。谷氨酰胺遺傳損傷的類型（2）染色體畸變

(chromosomeaberration)是DNA受損后發(fā)生染色體斷裂或染色單體斷裂所致的染色體結(jié)構(gòu)改變，可用光學(xué)顯微鏡觀察。染色單體型畸變指畸變僅涉及復(fù)制染色體中兩條染色單體中的一條。染色體型畸變指畸變涉及兩條染色體。染色體畸變原因：多方面的母親受孕年齡：過大，子代發(fā)生染色體病的可能性愈大，可能與母體卵子老化有關(guān)。放射線：人類染色體對輻射很敏感，孕婦接觸放射線后，其子代發(fā)生染色體畸變的危險性增加。病毒感染：傳染性單核細胞增多癥、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和肝炎等病毒都可引起染色體斷裂，造成胎兒染色體畸變。化學(xué)因素：許多化學(xué)藥物、抗代謝藥物和毒物都能導(dǎo)致染色體畸變。遺傳因素：染色體異常的父母可遺傳給下一代。例：對胎兒的影響美軍在侵越戰(zhàn)爭時：使用落葉劑，2，4，5-T，是氯化苯基化合物，其中含有二噁英，是強致畸劑。在被此落葉劑污染區(qū)生活了2個月以上的4名孕婦，3人生產(chǎn)了畸形兒，出現(xiàn)了明顯的染色體斷裂、缺失等現(xiàn)象。染色體結(jié)構(gòu)異常的類型缺失

染色體上丟失了一個片斷重復(fù)

染色體片斷在一套染色體中出現(xiàn)不止一次，如ABCDEABCDEde倒位

一個染色體片斷被顛倒

如ABCDEFGABCEDFG易位

一個染色體片斷的位置改變

如ABCDEABCIJFGHIJFGHDE

染色體缺失及環(huán)狀染色體的形成圖

染色體插入和重復(fù)示意圖

染色體的臂間倒位

染色體相互易位示意圖

abcdefga：染色單體斷裂；b：三輻射體；c：染色體斷片；d：雙著絲點染色體；e：環(huán)狀染色體；f,g：無著絲點斷片遺傳損傷的類型（3）染色體數(shù)目畸變（numericalaberration）又稱染色體分離異常，染色體數(shù)目改變非整倍體

指增加或減少一條或幾條染色體。如單體、三體。整倍體

指以染色體組為單位增減的染色體數(shù)目異常。如3n、4n。三體性個體唐氏綜合征患者：核型是47,XX或XY,21，即21號染色體比正常人多一個。人群中發(fā)病率：1：700原因：卵子或精子發(fā)生的減數(shù)分裂過程中染色體的不分離，結(jié)果是21號染色體多了一條，多出的一條染色體破壞了正?；蚪M遺傳物質(zhì)間的平衡?；純褐橇Φ拖拢B面部畸形及特殊面容，肌張力低下，多并發(fā)先天性心臟病，患者白血病的發(fā)病率為普通人群的10-20倍。生活難以自理，一般認(rèn)為平均壽命為40歲。

唐氏綜合征21染色體：3條太原地區(qū)的唐氏綜合癥的調(diào)查162例唐氏綜合癥患者母親懷孕早期(前3個月)因感冒，牙疼，嘔吐嚴(yán)重等原因服藥者31例占19.1%，服藥(抗生素，保胎安眠藥，感冒藥、中藥等)；父母有吸煙飲酒史57例，占35.1%；城鎮(zhèn)唐氏綜合癥的父母孕前3個月裝修房屋的16例，9.8%；患兒父母長期接觸化學(xué)有害物質(zhì)的37例，22.8%避免措施35歲以上的高危孕婦：容易生出唐氏綜合癥患兒。調(diào)查的162例唐氏綜合癥患兒中母親大于35歲的11例占6.8%(11/162)。孕早期的感染：盡量避免用藥、長期吸煙、飲酒與有毒有害物質(zhì)的直接接觸，如：家裝及化學(xué)污染(除草劑、殺蟲劑等)。突變的后果體細胞突變良性腫瘤惡性轉(zhuǎn)化細胞衰老已分化胚胎細胞受損未分化胚胎細胞受損動脈硬化癌變未知疾病老化流產(chǎn)與死胎功能或結(jié)構(gòu)畸形胚胎綜合癥顯性致死突變的后果生殖細胞突變顯性致死隱性致死存活突變流產(chǎn)與死胎胚胎綜合癥功能和結(jié)構(gòu)畸形生育功能障礙遺傳性疾病基因負荷（二）致突變物的檢測方法致突變物一般通過致突變試驗檢測。致突變試驗中應(yīng)注意：觀察的效應(yīng)終點類型試驗配套遺傳學(xué)終點遺傳學(xué)終點指致突變試驗中觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件。國際環(huán)境致突變物致癌物防護委員會(ICPEMC)將其分為5類：DNA完整性改變DNA重排或交換DNA堿基序列改變?nèi)旧w完整性改變?nèi)旧w分離異常為什么要試驗配套？外源化學(xué)物種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，致突變機制不同，作用的靶細胞不同。誘變物中，少數(shù)為直接作用，多數(shù)要經(jīng)代謝后才有致突變作用，為間接作用。誘變物的致突變性有強弱之分，要通過在不同的檢測系統(tǒng)檢測。試驗配套的原則原則：不同類型的遺傳學(xué)終點原核細胞和真核細胞體內(nèi)試驗和體外試驗體細胞和生殖細胞主要致突變試驗Ames試驗微核試驗顯性致死試驗染色體畸變試驗姐妹染色單體交換試驗小鼠淋巴瘤試驗程序外DNA合成試驗果蠅伴性隱性致死試驗精子畸形試驗配套組合實例Ames試驗

DNA堿基序列改變小鼠微核試驗染色體完整改變和分離改變細菌DNA修復(fù)試驗

DNA完整性姐妹染色單體交換試驗（SCE）

染色體完整性改變和DNA重排或交換1.細菌回復(fù)突變試驗(Ames)試驗

AmesBN．等經(jīng)十余年努力，于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復(fù)突變試驗；

Ames試驗是目前應(yīng)用最廣泛，與致癌相關(guān)度最好（約80％）的試驗方法之一，現(xiàn)已被許多國家或組織推選為篩選致癌物的首選試驗；比較快速、簡便、敏感、經(jīng)濟；適用于測試混合物，反映多種污染物的綜合效應(yīng)。細菌回復(fù)突變試驗(Ames)試驗原理

正向突變

野生型細菌突變型細菌

（原養(yǎng)型）

回復(fù)突變

（組氨酸缺陷型）鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株在無組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長，在有組氨酸的培養(yǎng)基上才能正常生長，但如在無組氨酸的培養(yǎng)基中有致突變物存在時，則沙門氏菌突變型可回復(fù)為野生型，在無組氨酸培養(yǎng)基上也能生長；根據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能使沙門氏菌突變型產(chǎn)生回復(fù)突變，代謝活化系統(tǒng)可以用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿(S-9)制備的S-9混合液。檢測食品添加劑、化妝品、獸藥等的致突變性，由此推測其致癌性；檢測水源水和飲用水的致突變性，探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施；檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學(xué)分析，追蹤污染源；檢測土壤、污泥、工業(yè)廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性，以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，通過農(nóng)作物危害人類；Ames試驗的應(yīng)用檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)由大氣，通過呼吸對人體發(fā)生潛在危害；檢測農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對人類有無隱患；研究化合物結(jié)構(gòu)與致變性的關(guān)系，為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供理論依據(jù)；篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗癌藥等等。

Ames試驗的應(yīng)用不適用的受試物不適用于具有殺菌或抑菌作用的受試物；不適用于具有妨礙哺乳動物細胞復(fù)制系統(tǒng)的受試物。Ames試驗設(shè)計菌株

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌

TA97、TA98、TA100、TA102各種移碼型誘變劑：TA97、TA98引起堿基對置換的誘變劑：TA100檢出其它測試菌株不能檢出或極少檢出的誘變劑（如甲醛、過氧化氫化合物等）：TA102Ames試驗常用的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌株檢出突變類型TA97移碼TA98移碼TA1357移碼TA1359移碼TA100置換及移碼TA102置換及移碼TA104置換及移碼TA1535置換Ames試驗設(shè)計受試物最低劑量每皿0.1μg，最高劑量每皿5mg，設(shè)4~5個劑量方法平板摻入法Ames試驗設(shè)計鼠傷寒沙門氏菌直桿菌，革蘭氏陰性。產(chǎn)生內(nèi)毒素，引起腸胃炎和敗血癥。對外界環(huán)境的抵抗力較強，分布廣，許多家禽(雞、鴨、鴿等)、家畜(豬、牛、羊、馬、狗、貓等)、鼠類和飛鳥的腸道中儲有這種細菌。感染主要通過受污染的食物傳播。美國2008年花生醬感染：43個州發(fā)現(xiàn)沙門氏菌疫情，感染410人，3人死亡。Ames試驗的注意事項質(zhì)粒易丟失，故應(yīng)盡可能減少傳代；鼠傷寒沙門氏菌是條件致病菌，所以用過的器皿應(yīng)放入石碳酸中或進行煮沸滅菌，培養(yǎng)基也應(yīng)經(jīng)煮沸后倒棄；肝勻漿的提取應(yīng)重視無菌操作，并應(yīng)做無菌測定，提取過程盡可能用冰浴保持低溫。S-9混合液要在使用時隨時配制。

Ames試驗結(jié)果評定陽性誘發(fā)回變菌落數(shù)/自發(fā)回變菌落數(shù)≥2有劑量-反應(yīng)關(guān)系或至少某一測試點有重復(fù)，并有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)果應(yīng)是至少2次獨立試驗的重復(fù)結(jié)果陰性濃度達到5mg/皿為陰性者Ames試驗的特點快速簡便敏感檢出率高有假陽性結(jié)果因微生物遺傳信息較哺乳動物數(shù)量少、且結(jié)構(gòu)簡單，無免疫機能例：Ames試驗檢測喹賽多、喹乙醇受試物：喹乙醇菌種：TA97、TA98、TA100、TA102實驗動物：雄Wistar大鼠5只，用于制備S9Ames試驗所需大鼠肝S9制備雄性Wistar大鼠5只PCB溶于玉米油中500mg/kgb.w.劑量一次腹腔注射5d后斷頭處死，無菌取肝臟制備肝勻漿低溫9000g離心取上清，低溫保存?zhèn)溆肞CB：多氯聯(lián)苯S9無菌檢查和活力測定結(jié)果（A）（B）（A）不加S9的，（B）加S9的Ames試驗

劑量設(shè)計和分組：藥物：喹乙醇25μg/皿設(shè)陰性、溶劑、陽性對照、+S9和?S9平行試驗方法：標(biāo)準(zhǔn)平皿摻入法Ames試驗結(jié)果

喹乙醇25μg/皿：TA97,TA98,TA100(±S9)TA102(+S9)TA102(?S9)陽性Ames試驗結(jié)果(A)(B)(C)(D)(A)TA97陰性，(B)TA97陽性，(C)TA98陰性，(D)TA98陽性Ames試驗結(jié)果(E)(F)(G)(H)(E)TA100陰性，(F)TA100陽性，(G)TA102陰性，(H)TA102陽性例：投加二氧化氯后水的Ames變化

水樣處理步驟水樣→XAD樹脂吸附→乙酸乙酯洗脫→K－D濃縮器濃縮→氮氣吹干→DMSO→定容→致突變試驗

菌株的選擇試驗選用靈敏度較高的帶R因子的TA98和TA100菌株。這兩種菌種對飲用水中復(fù)雜的混合物有較高的敏感性。因飲用水中多為直接致突物，故不加肝微粒體酶（S9）活化系統(tǒng)。每一受試物的劑量做兩個平行樣用溶劑DMSO作陰性對照TA100以疊氮化鈉（NaN3）做陽性對照TA98以滅滴靈（MDI）為陽性對照。致突結(jié)果用突變率（MR）表示，

突變率MR＝（誘變菌落平均數(shù)／皿）/（空白對照菌落平均數(shù)／皿）

水樣的Ames試驗結(jié)果Ames試驗結(jié)果細菌名稱水樣體積／L原水突變率出水突變率TA1002.0

1.5

1.0

0.5

3.15

2.78

1.87

1.551.46

1.40

1.20

1.04TA982.0

1.5

1.0

0.5

5.33

3.89

2.63

1.932.08

2.68

2.04

1.76二氧化氯對水樣結(jié)果的分析TA100菌種：原水的4個水樣中均出現(xiàn)陽性結(jié)果，其中有二個水樣的突變率大于2。圖1：劑量反應(yīng)關(guān)系基本為直線，說明原水對TA100菌種有較強的致突變活性。出水的4個水樣中突變率均小于2.0，從圖1沒有顯示明顯的線性關(guān)系，說明已基本不存在致突變活性。

對水樣結(jié)果的分析TA98菌種：原水的4個水樣中3個水樣的突變率大于2。圖2：劑量反應(yīng)關(guān)系基本為直線，因此說明原水對TA98菌種也有較強的致突變活性。TA98菌種：出水的4個水樣突變率均在2左右，劑量反應(yīng)關(guān)系沒有呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，說明出水中致突變活性已大大降低。結(jié)論Ames試驗：被石油類物質(zhì)污染的飲用水經(jīng)過投加二氧化氯氧化后，致突變活性明顯降低，Ames值由陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?。二氧化氯：對飲用水中石油類污染物具有較強的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的萘系物和苯系物氧化降解為毒性較小、無致癌作用的物質(zhì)。

露華濃染發(fā)劑等五品牌檢出

含致癌物間苯二胺央視曝光“一洗黑”事件2009年3月：廣東，5批次染發(fā)劑樣品均含有間苯二胺?！奥度A濃麗然染發(fā)劑[(黑色)美國]”；“生態(tài)1號瑩翠營養(yǎng)蛋白染發(fā)霜”；“雪完美延采護發(fā)染發(fā)霜(自然黑)”；“歐威雅植物彩色焗油(自然黑)”；

“康臣3in1新彩絲護染霜”。間苯二胺是一種工業(yè)染料，是一種國際公認(rèn)的“三致”物質(zhì)——致癌、致突變、致畸。根據(jù)國家

《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)規(guī)定，間苯二胺在染發(fā)劑中是禁用的。例：特殊用途化妝品的Ames試驗染發(fā)劑：長期使用、職業(yè)接觸會導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤、膀胱癌的發(fā)生；王潤潔：報導(dǎo)2例因長期使用染發(fā)劑染發(fā)誘發(fā)再生障礙性貧血，分別死于腦出血和敗血癥；檢驗類型：2004-2006年，進口及國產(chǎn)染發(fā)、育發(fā)、美乳及健美四種；數(shù)量：237份；目的：研究其致突變的潛在危害性。國產(chǎn)及進口染發(fā)劑的Ames試驗比較小心：氧化型的染發(fā)劑能引起Ames試驗陽性的均為氧化型染發(fā)劑，其中絕大多數(shù)是彩色染發(fā)劑。2.微核試驗微核(micronucleus)又稱豪-杰氏小體(Ho-well-Jollybodies)

是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損而丟失的整個染色體，在細胞有絲分裂后期滯留在細胞質(zhì)中的顆粒。其大小為細胞直徑的1/20~1/5，呈圓形或杏仁狀，著色與細胞核一致。

微核試驗即觀察外源化學(xué)物能否使細胞產(chǎn)生微核的試驗。觀察的遺傳學(xué)終點染色體完整性改變?nèi)旧w分離改變微核試驗的概念多染紅細胞(polychromaticerythrocytes，PCE)是晚幼紅細胞最后一次分裂時，排出主核而未成熟的紅細胞（灰藍色）正染紅細胞(normochromaticerythrocytes，NCE)是排出主核后成熟的紅細胞（粉紅色）試驗材料動物

小鼠7~12周齡，體重20~30g。藥物環(huán)磷酰胺（陽性對照）、藥物1/2-1/30LD50劑量環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液，2次腹腔注射，50mg/kg，間隔24h，第2次注射后6小時取材環(huán)磷酰胺水溶液，80~120mg/kg，經(jīng)口染毒2次，間隔24h操作步驟（1）骨髓細胞液的制備在第2次給與受試物6h后，小鼠脫頸椎處死，取胸骨，用濾紙或紗布擦干血污和肌肉涂片在潔凈的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，用止血鉗將骨髓擠到血清中，混勻，推片，干燥固定將干燥的涂片置甲醇液中固定5~10min，取出晾干染色

固定好的圖片用1∶10的吉姆薩-磷酸鹽緩沖液（pH6.4）染色15~30min，蒸餾水沖洗，干燥鏡檢先用低、高倍鏡粗檢，選擇細胞完整、分布均勻和染色好的區(qū)域，再以油鏡檢查計數(shù)

制片優(yōu)劣判斷標(biāo)準(zhǔn)細胞形態(tài)完好，嗜多染紅細胞（PCE）呈灰藍色，成熟的正染紅細胞（NCE）呈粉紅色或桔黃色。

操作步驟（2）計數(shù)每只動物計數(shù)1000個PCE，并計算含微核的PCE數(shù)，以千分率表示。在一個PCE中有2個或多個微核，仍按一個微核細胞計算。在計數(shù)PCE時，同時計數(shù)見到的NCE，求PCE/NCE。

操作步驟（3）結(jié)果分析與評價每組分別計算雌、雄動物微核PCE的均值，與對照組比較。正常PCE/NCE約為1（正常范圍0.6~1.2），如比值小于0.1，表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如比值小于0.05，表示受試物劑量過大，實驗結(jié)果不可靠。PCENCE微核試驗的不足有些化學(xué)物在骨髓中難以達到損害濃度在肝臟活化的中間產(chǎn)物可能在到達骨髓前消失骨髓中PCE處于動態(tài)平衡一般觀察體細胞，其結(jié)果外推至其他組織應(yīng)慎重機動車尾氣對小鼠骨髓細胞

的致突變性研究

目的：探討機動車尾氣對小鼠骨髓細胞的致突變性。方法：健康昆明種小鼠40只隨機分4組，雌雄各半。通過自制動式染毒裝置將小鼠分別在新鮮空氣、1：15、1：10、1：5不同濃度的機動車尾氣中暴露，連續(xù)5天，每天1小時。測定小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)中的微核率的變化。結(jié)果：染毒濃度與小鼠骨髓細胞微核率存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：機動車尾氣對小鼠骨髓細胞有致突變作用。結(jié)論骨髓細胞微核率：存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。表明：機動車尾氣中存在著某種能致突變的污染物，具有較強的致突變作用。動物或人：長期在高濃度機動車尾氣污染的大氣環(huán)境中，將會導(dǎo)致不良的遺傳學(xué)效應(yīng)。小孩：在機動車多的地方要抱起來。3.小鼠精子畸形試驗

精子畸形試驗是檢測受試化學(xué)毒物能否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的實驗方法。適用范圍適用于評價食品生產(chǎn)、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學(xué)、生物和物理因素的遺傳毒性；檢驗對象：食品添加劑（含營養(yǎng)強化劑）、食品新資源及其成分、新資源食品、輻照食品、食品容器與包裝材料、食品工具、設(shè)備、洗滌劑、消毒劑、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、食品工業(yè)用微生物等。原理小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子的畸形：主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。

試驗材料動物

小鼠6~8周齡，體重25~35g。藥物環(huán)磷酰胺（陽性對照）、藥物可采用LD50的1/2-1/10倍劑量劑量環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天操作步驟在第1次染毒后第7，28，70天，處死小鼠檢查精子形態(tài)。各種致突變物作用于精子的不同發(fā)育階段，可在接觸某種致突變物后不同時間出現(xiàn)精子畸形。精子畸形：主要在頭部，其次為尾部?；晤愋涂煞譃榕诸^、無定形、雙頭、尾折疊、雙尾、無鉤、香蕉形等。正常人精子形態(tài)閱片注意事項分別記錄異常類型，以便統(tǒng)計精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。判斷雙頭、雙尾畸形時，要注意與二條精子的部分重疊相鑒別，判斷無定形時要與人為剪碎及折疊相鑒別。使用的小鼠要健康，以免感染、體溫增高等可能導(dǎo)致精子畸形率增高的因素造成假陽性結(jié)果。

結(jié)果分析與評價計算精子畸形發(fā)射率，與陰性對照組比較，畸形率至少為陰性對照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計有顯著意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系。一般陰性對照組的精子異常率為0.8％～3.4％。丙烯腈對大、小鼠精子形成影響的研究

丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是制造腈綸纖維、丁腈橡膠和合成樹脂等的重要有機合成單體，用途極廣。隨著石油化工、化纖工業(yè)的迅猛發(fā)展，接觸ACN的人群日益增多。長期接觸ACN工人中腫瘤，特別是肺癌發(fā)生的危險度增高。ACN對大鼠具有致癌作用昆明小鼠雄性230只，隨機分為5組；ACN灌胃染毒，蒸餾水作溶劑，共染毒5d，劑量分別為0、6、12、24mg/kg，同時設(shè)陽性對照組。分別于染毒后1、2、3、4、5周處死動物，作精子畸形實驗；陽性對照物選用環(huán)磷酰胺(CTX)，劑量為40mg/kg，于第5周后1次腹腔注射。

丙烯腈對大、小鼠精子形成影響的研究

Wistar雄性大鼠，雄性58只；平均體重(189.2±15.3)g，隨機分為4組；蒸餾水作溶劑，ACN灌胃染毒，每天1次，每周5天，連續(xù)染毒13周。劑量分別為0、5、10、20mg/kg。

丙烯腈對大、小鼠精子形成影響的研究

試驗結(jié)果（1）小鼠精子畸形率

2周后，24mg/kg組精子畸形率已明顯高于對照組；

3周后，12mg/kg組也有影響；

5周后，12mg/kg與24mg/kg組精子畸形率明顯高于對照組，差異均有非常顯著性(P＜0.01)?；畏N類以頭部畸形為主，主要有不定形、無鉤和香蕉形。

試驗結(jié)果（2）大鼠精子畸形率

20mg/kg時，附睪尾精子數(shù)明顯低于對照組；

10mg/kg時，活精率就明顯低于對照組，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系；所有實驗組精子頭部畸形率與尾部畸形率均明顯高于對照組，并呈上升趨勢。

結(jié)論ACN對睪丸有毒性，對精子發(fā)育的各階段均有不同程度的影響，尤以精子細胞變態(tài)發(fā)育成精子這一階段對ACN毒性最敏感。原因：可能是ACN和CEO對生精細胞中遺傳物質(zhì)有烷化作用，而精子細胞與成熟精子無DNA修復(fù)能力，即使輕度損傷，亦易表現(xiàn)出來。在對接觸ACN的男工進行流行病學(xué)調(diào)查，評價其生殖毒性時，有一定的價值。

4.顯性致死試驗顯性致死(dominantlethal)指哺乳動物生殖細胞染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變，導(dǎo)致受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。顯性致死試驗以胚胎死亡為觀察終點，用于檢測哺乳動物生殖細胞遺傳性損傷。顯性致死試驗試驗設(shè)計實驗動物小鼠30~35g大鼠200~300g染毒

♂

一次、5~7d、30d交配

♂:♀=1:1或1:2同籠1周，第2周更換另一批，小鼠連續(xù)6~8批，大鼠8~12批檢查受精情況涂片鏡檢或檢查陰栓，以檢查出陰栓的時間為妊娠第0天剖殺小鼠妊娠第14d，大鼠第16d檢查著床數(shù)、早死胎、晚死胎、活胎數(shù)

顯性致死試驗結(jié)果分析

受孕雌性動物數(shù)受孕率=×100%

交配雌性動物總數(shù)著床胚胎總數(shù)平均著床數(shù)=

受孕雌性動物總數(shù)早期胚胎死亡數(shù)平均早期死亡胚胎數(shù)=

受孕雌性動物總數(shù)

顯性致死試驗結(jié)果評價陽性有劑量-反應(yīng)關(guān)系至少在一個劑量水平上出現(xiàn)可重復(fù)的并具有統(tǒng)計學(xué)意義的增高陰性不具有劑量-反應(yīng)關(guān)系在任何劑量水平上沒有可重復(fù)的并具有統(tǒng)計學(xué)意義的增高5.染色體畸變分析染色體畸變分析(chromosomeaberrationanalysis)

是將觀察細胞停留在分裂中期相，在顯微鏡下觀察染色體畸變和染色體分離異?，F(xiàn)象。第二節(jié)生殖發(fā)育毒性試驗（一）基本概念（二）生殖發(fā)育毒性試驗及評價■神話人物如獨眼巨人、海妖等的原型可能來自嚴(yán)重畸形的嬰兒獨眼巨人■Hybridtheory(雜交理論)認(rèn)為畸形是人和動物雜交的結(jié)果■并且這種雜交動物廣泛存在于神話傳說中，如人頭馬身怪物、人身牛頭等埃及獅神人面像環(huán)境污染物的致畸作用如：二噁英四環(huán)素—牙胚發(fā)育異常造成牙齒色素沉著和發(fā)育不良鏈霉素和慶大霉素——聽神經(jīng)發(fā)育障礙形成先天性耳聾環(huán)境激素問題反應(yīng)停事件甲基汞公害事件社會、政治和衛(wèi)生領(lǐng)域帶來了新的研究課題反應(yīng)停(thalidomide)事件孕婦的理想選擇？■1953年，聯(lián)邦德國一家名為Chemie

Gruenenthal的制藥公司研究人員發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)停具有一定的鎮(zhèn)靜安眠作用，而且對孕婦懷孕早期的妊娠嘔吐療效極佳■1957年10月1日該公司將反應(yīng)停正式推向市場反應(yīng)停便成了“孕婦的理想選擇”（當(dāng)時的廣告用語），在歐洲、亞洲、非洲、澳洲和南美洲被醫(yī)生大量處方給孕婦以治療妊娠嘔吐科學(xué)家們在研制反應(yīng)停時，并沒有料到這種藥物會產(chǎn)生如此可怕的副作用令人恐怖的副作用到1960年，本地區(qū)畸形嬰兒的出生率明顯上升。四肢畸形（主要是雙上肢的短肢畸形）腭裂盲兒或聾兒內(nèi)臟畸形?調(diào)查顯示，孕婦懷孕時末次月經(jīng)后第34～50天是反應(yīng)停作用的敏感期

?在此時間段以外服用反應(yīng)停，一般不會導(dǎo)致胎兒的出生缺陷

支付巨額賠償金■1970年4月10日，案件的控辯雙方于法庭外達成了和解，Chemie

Gruenenthal

公司同意向控方支付總額1.1億德國馬克的賠償金反應(yīng)停對于接受大劑量化學(xué)治療后又復(fù)發(fā)的骨髓瘤患者有效多發(fā)性骨髓瘤：一種漿細胞癌，主要發(fā)生在骨髓中的白細胞類型癌。隨著癌的生長，正常骨組織被破壞，引起疼痛和正常細胞外生。在美國大約有40,000到50,000個多發(fā)性骨髓瘤病人，每年的新發(fā)作病例為14,000例，使其成為排名第二的常見血癌。估計2001年大約有11,200個多發(fā)性骨髓瘤病人死亡。傳統(tǒng)化學(xué)治療方法對該病無效。四環(huán)素牙先天性水俁（yǔ

）病患者服用過量維生素引起的畸形?維生素A每日服用5萬單位（相當(dāng)于濃縮A丸劑2丸、或濃縮魚肝油滴劑30滴），連續(xù)3個月，會使胎兒骨骼畸形、并趾、腭裂、眼與腦畸形、腎及中樞神經(jīng)損害。WHO對16個國家畸形發(fā)生率的分析新生兒數(shù)：426932人畸形兒數(shù)：7385人總發(fā)生率：1.73%1965年日本新生兒的畸形發(fā)生率為6％1984年上升為14％，20年內(nèi)增長了1倍多。

四肢26%神經(jīng)管17%泌尿生殖系統(tǒng)14%顏面9%消化系統(tǒng)8%心血管系統(tǒng)4%多發(fā)性畸形22%神經(jīng)管畸形患兒發(fā)病率神經(jīng)管畸形(neuraltubedefect簡稱NTD)主要包括：脊柱裂和無腦兒，是常見的嚴(yán)重的出生缺陷。全世界每年大約有40萬個病例。美國每年約4000個新出生的神經(jīng)管畸形兒中有2500個存活的脊柱裂，其每年的醫(yī)療和手術(shù)花費超過了2億美元。

中國的神經(jīng)管畸形患兒中國：每年7～8萬個神經(jīng)管畸形兒出生。全國29個省、市和自治區(qū)的945所醫(yī)院的監(jiān)測結(jié)果，發(fā)生率在0.66‰~10.56‰之間，平均數(shù)為2.7‰。趨勢：從北到南，從東到西逐漸減弱，農(nóng)村發(fā)病率高于城市。發(fā)生率呈下降趨勢：1988年2.5‰，1992年1.8‰，1998年1.3‰。神經(jīng)管發(fā)病率高：北方地區(qū)或南方的貧困地區(qū)原因：葉酸含量豐富的食物如綠葉蔬菜、青豆和水果類較少，特別在冬季，某些地區(qū)仍以儲存的大白菜或腌制的咸菜為主要蔬菜。中國人炒煮的烹飪方式將使蔬菜中的葉酸損失很大。人們習(xí)慣于新年和春節(jié)期間結(jié)婚，新婚夫妻會在短時間內(nèi)懷孕，孕婦懷孕初期正是吃不到綠色蔬菜的冬末春初季。而在中國70％的人口生活在農(nóng)村，大多數(shù)的新婚夫婦生活在丈夫家里。此時新嫁娘是置身于一種新的生活和社會環(huán)境中，甚至經(jīng)濟上也依靠夫家，在這種情況下她自己來選擇食物的品種是非常有限的。這些因素說明在北方農(nóng)村和南方的貧困地區(qū)，從飲食中獲得足量的葉酸似乎不太可能。補充葉酸。怎么預(yù)防呢？?畸形

：指出生前因素引起發(fā)育生物體的嚴(yán)重的解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷(異常)?對發(fā)育、生長、生理功能、生育力和（或）壽命可產(chǎn)生有害影響?可以存活也可能不能存活?致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前）接觸外源性理化因素引起后代結(jié)構(gòu)畸形的特性或作用?致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)（一）基本概念例：導(dǎo)致胎兒畸形42℃水浴處理早孕小鼠10min，會使胚胎全腦細胞數(shù)和腦乙酰膽堿酯酶活力顯著低于37℃激素：甲狀腺素、黃體酮、雄激素等均可導(dǎo)致胎兒畸形?致畸物：凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化學(xué)物稱為致畸物或致畸原。

?畸胎：具有畸形的胚胎或胎仔（一）基本概念?胚胎毒性：通常是指外源性理化因素造成的孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束的所有的毒性。?表現(xiàn)為：胚胎期染毒而出現(xiàn)畸胎、生長遲緩、著床數(shù)減少和吸收胎，也偶有晚死胎。胚胎-胎兒毒性基本概念?胎兒毒性

：指器官形成期結(jié)束后的因素引發(fā)的任何毒性表現(xiàn)?包括死亡、體重降低、骨化遲緩、功能缺陷以及結(jié)構(gòu)異常，甚至腫瘤?在實驗動物發(fā)育毒性試驗中，通常不去區(qū)分胎兒與胚胎，所以使用胚胎-胎兒毒性更恰當(dāng)基本概念生殖毒性(reproductiontoxicity)

指化學(xué)物對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生的不良效應(yīng)。生育力和一般生殖行為致畸形對懷孕后期和哺乳的影響基本概念?發(fā)育毒性：指出生前經(jīng)父體和/或母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達成體之前內(nèi)出現(xiàn)的有害作用。包括：①結(jié)構(gòu)畸形②生長遲緩③功能障礙④死亡基本概念?出生缺陷：是指嬰兒出生前即已形成的發(fā)育障礙包括：■形態(tài)結(jié)構(gòu)異常：畸形■功能缺陷：如智力低下，代謝和行為的異?；靖拍钪禄饔靡蛩貎烧叩慕换プ饔眠z傳因素環(huán)境因素物理因素化學(xué)因素生物因素弓行體：貓風(fēng)疹病毒巨細胞病毒單純皰疹病毒

紫外線X線熱輻射齲齒：口腔和舌癌放射性：白血病和皮膚癌（廣島、長崎）遺傳因素和畸形的關(guān)系先天性心臟畸形 35先天性巨結(jié)腸 80脊柱裂 60無腦兒 60先天性髖關(guān)節(jié)脫位 70腭裂 76先天性幽門狹窄 75遺傳度（%）畸形類型致畸毒性特點

1.有作用敏感期

器官形成期對致畸原特別敏感。不同器官有它特定的敏感期。掌握不同器官的特別敏感期，可以分別深入觀察受試物對不同器官的作用和致畸機理。

2.致畸作用存在顯著的種屬差異和個體差異

3.劑量—效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系復(fù)雜

相同劑量染毒時期不同，或著不同劑量引起的畸形類型和畸形發(fā)生率有很大差異。致畸作用帶0100發(fā)生率（%）致畸率死亡率致畸作用帶劑量小大發(fā)育毒性機制（1）1.基因突變和染色體畸變

2.干擾DNA合成和有絲分裂有些藥物（如抗癌藥物和抗菌素）通過干擾RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯，引起畸形。發(fā)育毒性機制（2）3.干擾營養(yǎng)化學(xué)物質(zhì)引起母體的維生素、無機鹽、蛋白質(zhì)、嘌呤和嘧啶等生物合成原料營養(yǎng)不良或低血糖都可以引起畸形。如：EDTA引起妊娠母體內(nèi)無機微量元素代謝紊亂食品匱乏使低體重嬰兒出生率增加4.細胞毒性作用(膜損傷)5.性激素代謝干擾6.誘導(dǎo)氧自由基（活性氧）發(fā)育毒性機制（3）7.非特異性發(fā)育毒性非特異性發(fā)育毒性是指化合物對所有胚胎細胞生命基本功能的干擾現(xiàn)象。如：線粒體功能等。作用特點是，胚胎的全部組織受到損傷，引起胚胎生長緩慢，甚至死亡。

8.干擾母體和胎盤的正常結(jié)構(gòu)和功能化學(xué)物質(zhì)引起的母體營養(yǎng)缺乏或營養(yǎng)代謝失調(diào)，或者影響子宮和胎盤的正常結(jié)構(gòu)，血液循環(huán)障礙，影響由胎盤到胎兒的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，均可以引起胎兒畸形、生長緩慢甚至死亡。發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點（1）著床前期（2）器官形成期（3）胎兒期（4）圍生期和出生后的發(fā)育期（1）著床前期發(fā)育毒性

?從受精算起，到完成著床之前（人類為11-12天，嚙齒類動物為前6天）。?通常是未分化細胞受化學(xué)毒物損傷而致胚泡死亡，即著床前丟失

。?也有著床前接觸毒物導(dǎo)致畸形的例子，如環(huán)氧己烷、甲基亞硝脲（農(nóng)肥水）等。（2）器官形成期（胚胎發(fā)育期）?在致畸作用中，對致畸物最敏感的階段是器官發(fā)生期，一般稱為危險期(criticalperiod)或關(guān)鍵期。?自受精日計算：人是3-8周；大鼠約為9～17天；小鼠約為7.5～16天；家兔為11～20天。?在器官發(fā)生期中，致畸物與胚胎接觸可能造成形態(tài)結(jié)構(gòu)異常；也有可能發(fā)生胚胎死亡、生長遲緩。（3）胎兒期

?器官形成結(jié)束后（以硬顎閉合為標(biāo)志）即進入胎兒期(人類從56-58天起)，直到分娩。?特點：以組織分化、生長和生理學(xué)的成熟為主。?最容易表現(xiàn)的發(fā)育毒性是生長遲緩、特異的功能障礙（如神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機能的改變）、經(jīng)胎盤致癌和偶見死胎。?胎仔或胎兒對胚胎致死作用的易感性雖較胚胎為低，但仍有一定數(shù)目的死產(chǎn)胎發(fā)生。（4）圍生期和出生后的發(fā)育期

?主要表現(xiàn)：發(fā)育免疫毒性、神經(jīng)行為發(fā)育異常和兒童期腫瘤發(fā)育免疫毒性

?妊娠期或圍生期接觸某些外源性化學(xué)物，會嚴(yán)重影響出生后T細胞、B細胞和吞噬細胞的發(fā)育、遷移、歸巢和功能發(fā)育神經(jīng)毒性

?表現(xiàn)為對感覺、運動、自主和認(rèn)知的影響。?妊娠期飲酒：造成乙醇綜合癥胎兒。?妊娠期安定暴露：對F1代大鼠有一定的發(fā)育及神經(jīng)行為毒性，表現(xiàn)為早期生理發(fā)育和神經(jīng)行為發(fā)育滯后等表現(xiàn)。（4）圍生期和出生后的發(fā)育期

兒童期腫瘤?圍生期是一生中對致癌物最敏感的時期，許多兒童期高發(fā)的腫瘤（急性淋巴細胞性白血病、神經(jīng)母細胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺瘤等）都可能與出生前因素有關(guān)。?因為這一時期細胞增殖快，藥物代謝酶的個體發(fā)生不全，免疫監(jiān)視功能低。（4）圍生期和出生后的發(fā)育期

人類胚胎的致畸敏感期器官發(fā)生前期器官發(fā)生期

（胚胎期）胎兒期1364521211109873820

中樞神經(jīng)系統(tǒng)心耳眼上肢下肢唇牙腭致畸敏感度高致畸敏感度低外生殖器（二）生殖發(fā)育毒性試驗及評價1.三段生殖毒性試驗（1）一般生殖毒性試驗（2）致畸試驗（3）圍產(chǎn)期試驗2.繁殖試驗3.體外試驗分別在3個不同階段給予受試物。I段試驗：即一般生殖毒性試驗，在妊娠（shēn

）前期及初期給予受試物；II段試驗：即致畸試驗，在器官形成期給予；III段試驗：即圍產(chǎn)期試驗，在圍產(chǎn)期及授乳期給予。I、II段試驗與傳統(tǒng)的繁殖試驗和傳統(tǒng)的致畸基本相似，III段試驗是觀察化合物對胎兒出生后發(fā)育的影響。1.三段生殖毒性試驗大鼠（1）一般生殖毒性試驗?zāi)康模涸u價化學(xué)物對配子成熟、交配行為、受孕能力、胚胎著床前和著床的影響方法動物初成年、未交配、健康有生育能力的雌雄大鼠各20只/組劑量高劑量有輕度毒性反應(yīng)低劑量稍高于藥效劑量中劑量按對等比級差處理雌鼠染毒14d，雄鼠60d受孕后20d處死檢查項目黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、死胎數(shù)、畸胎數(shù)、活胎數(shù)受精率、妊娠率、著床前、后的死亡率（1）一般生殖毒性試驗

著床前死亡率=×100%

著床后死亡率=×100%

吸收胎著床數(shù)黃體數(shù)—著床數(shù)黃體數(shù)（1）一般生殖毒性試驗結(jié)果評定（2）致畸試驗致畸試驗(teratologytest)

評價外源化學(xué)物的胚胎-胎兒毒性和致畸性所進行的試驗。目的確定受試物是否有致畸作用確定受試物誘發(fā)何種畸形即出現(xiàn)畸形的主要器官確定最大無致畸作用劑量和致畸閾劑量劑量原則：既求出NOEL和MEL，又保持母體生育能力，避免大批流產(chǎn)和過多胚胎死亡。最高劑量引起母體輕度中毒中間劑量母體出現(xiàn)某些較輕的中毒癥狀，與高低劑量等比最低劑量不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀對照組陽性、陰性或溶劑對照（2）致畸試驗接毒受孕動物在器官發(fā)生期（大鼠7~16d，小鼠6~15d），雄性動物不給受試物處死大鼠受孕后19~20d，即自然分娩前1~2d。注意：各劑量組與對照組動物處死時間應(yīng)一致，因胎仔在臨床出生前發(fā)育極為迅速，特別是骨骼。動物數(shù)每組至少存活20只懷孕動物。（2）致畸試驗檢查項目子宮活產(chǎn)胎仔、死胎、吸收胎卵巢黃體數(shù)活產(chǎn)胎仔性別、逐只稱重，并按窩計算平均體重胎仔畸形檢查外觀畸形腦露、無尾、短肢等內(nèi)臟及軟組織畸形骨骼畸形（2）致畸試驗檢查項目胎仔內(nèi)臟檢查

胎仔用固定液固定2周以上，肉眼和解剖鏡觀察。胎仔骨骼檢查

胎仔用80%酒精固定、KOH溶液處理、透明、染色后觀察。（2）致畸試驗結(jié)果評定計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)：畸形總數(shù)活產(chǎn)胎仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)=

活產(chǎn)仔總數(shù)

出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)畸胎出現(xiàn)率=×100%

活產(chǎn)仔總數(shù)（2）致畸試驗出現(xiàn)畸胎的母體數(shù)母體畸胎出現(xiàn)率=×100%

妊娠母體數(shù)雌鼠LD50

致畸指數(shù)=

最小致畸劑量結(jié)果評定（2）致畸試驗致畸指數(shù)＜10無致畸作用10~100有致畸作用＞100有強致畸作用（2）致畸試驗評價（3）圍產(chǎn)期毒性試驗?zāi)康脑u價在孕后期至斷奶之間受試物時對孕鼠/哺乳鼠和胎兒/新生兒潛在的不良影響。動物大鼠接毒時間孕期6~20d劑量同一般生殖毒性試驗觀察指標(biāo)（大鼠產(chǎn)后28d處死孕鼠）母鼠體重、受孕率、孕期、產(chǎn)仔數(shù)、死亡率仔鼠外觀畸性，幼仔出生、4d、21d存活率、生長指數(shù)仔鼠生理發(fā)育指標(biāo)出牙、張耳、睜眼、睪丸下降、陰道張開行為反射指標(biāo)平面翻正、運動狀況、觸須定位、空中翻正、視覺定向、負趨地性、懸崖回避（3）圍產(chǎn)期毒性試驗2.繁殖試驗繁殖試驗(reproductionstudy)

是評價化學(xué)物對親代生殖和后代的發(fā)育與生殖影響的試驗。試驗內(nèi)容一代繁殖試驗多代繁殖試驗（兩代、三代）多代繁殖試驗可彌補三段生殖毒性試驗中未能觀察生殖毒性在子代表現(xiàn)的不足。整個生命期內(nèi)接觸受試物，更符合生物長期低劑量接觸的情況。一代繁殖試驗示意圖兩代繁殖試驗示意圖第一代第二代觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)分別計算出生后第4、7、14、21天的存活率出生存活率出生后第4天幼仔存活率哺乳存活率出生后第21天幼仔存活率F1代的雌雄配子，連續(xù)接觸受試物在F0代的子宮內(nèi)→F1代出生→發(fā)育期受試物對性細胞的早期損害，一般在F1代均能表現(xiàn)出來較3代繁殖試驗節(jié)約時間和經(jīng)費兩代繁殖試驗的優(yōu)點3.體外試驗大鼠的全胚胎培養(yǎng)法胚胎細胞微團培養(yǎng)法胚胎干細胞培養(yǎng)法生精細胞與間質(zhì)細胞共培養(yǎng)法用途：

研究致畸作用機理初步篩選化學(xué)致癌物第三節(jié)致癌試驗一、與致癌作用有關(guān)的代謝二、化學(xué)致癌作用的機制三、化學(xué)致癌過程四、非遺傳毒性致癌機制五、化學(xué)致癌物及其分類六、對化合物的致癌性評價試驗毒理學(xué)中“癌”的概念是廣義的包括：

?上皮細胞的惡性病變（癌）?間質(zhì)細胞的惡性病變（肉瘤）?良性腫瘤腫瘤是一類嚴(yán)重影響人類健康和生命的疾病?惡性腫瘤已成為人類死亡的第一位或第二位原因，每年全世界約有700萬人死于癌癥?我國惡性腫瘤在各種死因中排列第二位，城市已排列首位化學(xué)致癌歷史1775年珀西瓦爾·波特（percival

pott）

早年曾干過掃煙囪活計的男人患上陰囊癌。波特提出了發(fā)病與特殊因素或環(huán)境有密切關(guān)系的癌種。1875年德國褐煤干餾工人中（瀝青鈾礦），肺癌發(fā)病率高1919年有人用煤焦油涂抹兔子耳朵，日久誘發(fā)出上皮癌。1930年從煤焦油中提煉出特殊致癌成分3-4苯并芘，動物實驗可引起皮膚癌、肉瘤等。世界范圍內(nèi)生產(chǎn)合成染料——膀胱癌高發(fā)

皮膚癌和白血病在手表指針上涂抹發(fā)冷光的鐳的婦女，因為常常舔刷毛，經(jīng)診斷患有舌癌。20世紀(jì)50年代早期吸煙人群的肺癌發(fā)病率日漸上升，比不抽煙的人群高上20至30倍。

1950-2005年間我國腫瘤死亡率趨勢36.9115.34123.92135.59114.2346.1219451960197519902005年份020406080100120140160腫瘤死亡率（1/10萬）1950-2001年間我國腫瘤死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的構(gòu)成比變化趨勢5.178.5918.8420.5722.3924.930153045607590105構(gòu)成比（％）195719631975198219912001年份惡性腫瘤其他死因主要致癌因素物理因素

如；電離輻射。經(jīng)常接觸X射線的醫(yī)務(wù)人員中，白血病、皮膚癌、甲狀腺癌的發(fā)病率均高于不接觸X射線的醫(yī)務(wù)人員。國外388名15歲以下兒童患中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率與其父親從事電離輻射有關(guān)?；瘜W(xué)因素

化學(xué)致癌物是一類可以使正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，發(fā)展為癌的化學(xué)物。生物因素乙型肝炎病毒——肝癌乳頭狀瘤病毒——食管癌、人類宮頸癌

EB病毒——鼻咽癌和惡性淋巴瘤

T系淋巴系病毒I型——T細胞白血病淋巴瘤

HIV——多發(fā)性人類腫瘤?腫瘤發(fā)生過程是宿主與環(huán)境之間發(fā)生復(fù)雜的、動態(tài)的相互作用過程重要的宿主因素----遺傳構(gòu)成和健康狀況主要的環(huán)境因素----食物、環(huán)境污染、職業(yè)和生活方式（如飲食習(xí)慣、吸煙等）一般估計，80%～90%的人類腫瘤與環(huán)境有關(guān)，其中主要是化學(xué)因素?要降低腫瘤的發(fā)生率，首先必須識別、鑒定化學(xué)致癌因素和有害的生活方式，闡明其作用機理，然后采取措施加以防治研究化學(xué)致癌作用具有重要的作用腫瘤是可以預(yù)防的?化學(xué)致癌物：指凡能引起動物和人類腫瘤、增加其發(fā)病率或死亡率的化學(xué)物。如黃曲霉毒素、苯并芘

?化學(xué)致癌作用：指化學(xué)致癌物在體內(nèi)引起腫瘤的過程?致癌物多數(shù)具有遺傳毒性?具有遺傳毒性的致癌物盡管化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不盡相同，但有一共同的特點，即皆為親電子劑?直接致癌物：指本身直接具有致癌作用，在體內(nèi)不需要經(jīng)過代謝活化即可致癌的物質(zhì)。這類物質(zhì)絕大多數(shù)是合成的有機物。包括有內(nèi)酯類如β-丙烯內(nèi)酯等；烯化環(huán)氧化物如1，2，3，4-丁二烯環(huán)氧化物；亞胺類；硫酸酯類；芥子氣和氮芥；活性鹵代烴類等等。?間接致癌物：指本身并不致癌，必須在體內(nèi)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化，其所形成的代謝產(chǎn)物才具有致癌作用的物質(zhì)。如亞硝胺類，多環(huán)芳烴

一、與致癌作用有關(guān)的代謝前致癌物近致癌物終致癌物代謝酶代謝酶?前致癌物:本身并不直接致癌，必須在體內(nèi)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化才具有致癌作用，尚未代謝活化的形式，即母體化合物。如亞硝胺類，多環(huán)芳烴?近致癌物:指前致癌物經(jīng)代謝活化過程形成的中間產(chǎn)物，必須進一步代謝活化才具有致癌作用的物質(zhì)。?終致癌物:不需代謝活化的直接致癌物和間接致癌物經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化最后產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物的統(tǒng)稱?；瘜W(xué)致癌機制分為：

?體細胞突變致癌學(xué)說：即造成DNA損傷而引發(fā)腫瘤的遺傳毒性機制?非突變致癌學(xué)說：即對DNA以外靶分子作用的非遺傳毒性機制二、化學(xué)致癌作用的機制?致癌作用是復(fù)雜的、多階段、多基因參與、長期累積的過程，涉及基因表達、細胞生理和生化等多種變化。?從本質(zhì)上說，腫瘤是一種遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致的疾病，即遺傳病。?大多數(shù)環(huán)境因素的致癌作用都是通過影響遺傳基因起作用的，腫瘤是細胞中多種基因突變累積的結(jié)果。（一）DNA加合物親電性化合物DNA,RNA,蛋白質(zhì)親核基團加合物基因突變結(jié)構(gòu)改變腫瘤細胞，血液，尿等共價結(jié)合?DNA加合物在化學(xué)致癌作用過程中起到關(guān)鍵作用，是引起腫瘤的直接原因之一支持這一觀點的實驗依據(jù)：1.大多數(shù)致癌物同時也是致突變物

2.許多致癌物的致突變和致癌性質(zhì)取決于它們是否能轉(zhuǎn)變?yōu)橛H電子的代謝產(chǎn)物3.DNA加合物的水平通常與致癌性和致突變性成正相關(guān)

4.DNA和致癌物的相互作用可活化腫瘤基因（二）DNA修復(fù)與化學(xué)致癌?正確修復(fù)：受損的DNA完全回復(fù)原有的結(jié)構(gòu)與功能，不發(fā)生突變?錯誤修復(fù)：經(jīng)修復(fù)的DNA部分仍可能在結(jié)構(gòu)和功能上存在缺陷，細胞雖能