干細胞-成體干細胞

干細胞-成體干細胞第一頁，共50頁。概述成體干細胞分化的可塑性成體干細胞的體外培養(yǎng)和特性成體干細胞研究中的問題成體干細胞在再生醫(yī)學中的應用第二頁，共50頁。概述一、定義成體干細胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負有構建和補充某種組織的各種類型細胞潛能的干細胞,又稱組織特異性干細胞(Tissue-specificstemcell)。第三頁，共50頁。傳統(tǒng)觀點干細胞一旦分化成熟，就不再分裂增殖了；成體干細胞的發(fā)育潛能是限能或少能的；成體干細胞只能分化為特定組織器官若干類型細胞。第四頁，共50頁。轉折點1997年初，英國科學家Wilmut等用體外培養(yǎng)、高度分化的母羊乳腺細胞核移植入去核卵細胞，克隆出了“Dolly”。表明某些高度分化的體細胞核仍具有一套完整的遺傳信息，能指導胚胎發(fā)育成為一個完整的新個體。在特定的條件下，分化的體細胞仍具發(fā)育的全能性。第五頁，共50頁。與胚胎干細胞相比，成體干細胞具有許多優(yōu)勢：成體干細胞不存在組織相容性的問題，治療時可避免長期應用免疫抑制劑對患者的傷害。胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但這種分化是“非定位性”的。目前，尚不能控制胚胎干細胞在特定的部位分化成相應的細胞，容易導致畸胎瘤。成體干細胞也具有類胚胎干細胞的高度分化能力。第六頁，共50頁。二分化目前，比較一致的看法是：成體干細胞是一種尚未終末分化的、處于干細胞/祖細胞或前體細胞狀態(tài)的成體細胞；正常生理條件下，傾向分化為所在特定組織的若干種細胞；外界條件誘導下，成體干細胞能超越該特定組織，分化成其他的功能細胞，補充參與損傷組織的修復等。第七頁，共50頁。三特征多能性廣泛性遷移性可調控性增生活躍組織（如黏膜、骨髓）不活躍組組織（如神經脂肪、肺部）。體內發(fā)生轉分化的中介環(huán)節(jié)。Blau等將干細胞借助于循環(huán)穿梭于組織的特性成為“干細胞高速公路”。高度依賴于干細胞所處的三維空間結構和多維的分化信號。微環(huán)境中的細胞因子、同種或異種細胞之間的接觸、細胞外基質成分等對成體細胞的分化方向與進程起到重要的調控作用。第八頁，共50頁。成體干細胞分化的可塑性目前對于可塑性的機制有幾種假說:假說1成熟的組織內的確存在由胚胎時殘留下來的多能干細胞。Verfaillie等證實在成體許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎樣原始干細胞，表達胚胎干細胞的遺傳標志，體外的培養(yǎng)條件也基本類似于胚胎干細胞。第九頁，共50頁。假說2可塑性是細胞融合的結果。20世紀初期，通過細胞融合產生雜合體而改變細胞命運，例如將肌母細胞與纖維母細胞融合后，可在纖維母細胞內觀察到肌蛋白表達；將鼠骨髓細胞或神經細胞與胚胎干細胞共同培養(yǎng)后，骨髓細胞和神經細胞會產生明顯的逆向分化，獲得胚胎干細胞特征；第十頁，共50頁。最近有研究人員將熱休克的小氣道上皮細胞與骨髓間質干細胞共同培養(yǎng)，觀察到間質干細胞與損傷的氣道細胞融合新生出氣道上皮，而且融合率大于1%，推測在體內出現(xiàn)急性器官衰竭和組織壞死時有可能通過細胞融合完成組織修復.

第十一頁，共50頁。假說3細胞由成熟狀態(tài)去分化為較原始狀態(tài)，隨后再分化為成熟的其他類型細胞，“克隆羊多利”明確顯示細胞的遺傳信息可以被再程序化，體細胞可以去分化成為多能干細胞.

低等脊椎動物的研究，顯示損傷部位可以出現(xiàn)與胚胎發(fā)育類似的未分化細胞進行修復，嶸螺的研究表明其通過局部已分化終末細胞去分化完成修復功能.

第十二頁，共50頁。分化就是受精卵發(fā)育成成體的過程中，細胞完成結構功能定向改變的過程，實質是基因選擇性表達的結果。去分化就是脫分化，分化細胞失去其特有結構而變成具有未分化細胞特征的過程。在動物中,去分化細胞具有胚胎間質細胞的功能。在植物中,去分化細胞成為薄壁細胞,稱為愈傷組織(callus)。去分化往往隨之又發(fā)生再分化(redifferentiation)。第十三頁，共50頁。1、骨髓干細胞2、神經干細胞4、骨骼肌干細胞3、肝干細胞第十四頁，共50頁。1、骨髓干細胞骨髓由不同類型多種細胞成分組成的組織，除了分化的血細胞和間質細胞等，還存在兩類成體干細胞：一類是造血干細胞（hematopoieticstemcell,HSC）,能生成各種血細胞；另一類是間質干細胞（mesenchymalstemcell，MSC），能生成內皮細胞、脂肪細胞和成纖維細胞等。體外培養(yǎng)的骨髓細胞，HSC細胞呈懸浮集落生長，而MSC細胞則貼壁生長，通過換液很容易把兩者分開。第十五頁，共50頁。間質干細胞證明可分化為包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞等，也能分化成內皮細胞和內胚層的肝細胞。當MSC細胞移植入小劑量射線照射的宿主，則造血系統(tǒng)和胃腸道組織有所增多，表明MSC細胞在異常環(huán)境中，細胞分化的可塑性增加。第十六頁，共50頁。造血干細胞HSC移植至不同的體內微環(huán)境，可分化為3個胚層的各種類型細胞，包括心肌、骨骼肌、血管內皮系統(tǒng)、肝細胞、肺泡、食道、腸道、胃、膽管以及皮膚和神經細胞等。HSC細胞在體外培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)血細胞系之間，即淋巴細胞系與髓性細胞系之間和系內也存在分化方向的轉變。第十七頁，共50頁。Hematopoiesis造血HematopoieticstemcellCommonlymphoidprogenitor（淋巴系）Common

myeloidprogenitor（髓系）NKcellBcellTcellGran/MacprogenitorErythro/PltprogenitorRBCPlateletmacrophageneutrophilbasophileosinophil第十八頁，共50頁。2、神經干細胞神經系統(tǒng)中一類能自我更新，并產生神經元和神經膠質細胞的前體細胞。主要存在于中樞神經系統(tǒng)的兩個神經發(fā)生區(qū)域：腦的海馬區(qū)和次腦室區(qū)，以及包括脊髓等其他非神經性的區(qū)域。第十九頁，共50頁。通過個體發(fā)育不同階段的神經干細胞移植至宿主不同部位，發(fā)現(xiàn)神經干細胞移植分化為神經細胞的潛能具有發(fā)育階段的依賴性，說明成體中的神經干細胞分化潛能受到一定的限制。1999年，Bjornson將從成年小鼠腦組織分離的神經干細胞移植入經X射線照射過的小鼠骨髓部位，分化出血液細胞，開創(chuàng)了成體干細胞跨越組織或胚層分化研究的先例。第二十頁，共50頁。3、肝干細胞對肝干細胞存在與否的問題一直有爭論。對發(fā)育中的肝臟具有自我更新能力的細胞進行單克隆培養(yǎng)和分析，證明其內的卵圓形細胞在體外能大量增殖，細胞移植后可分化，表明肝卵圓形細胞是肝干細胞，具有分化為肝細胞和膽管上皮細胞的雙潛能性。第二十一頁，共50頁。肝干細胞的鑒定肝干細胞本身缺乏特異性標志，分離和鑒定帶來了困難。雙潛能的肝干細胞同時表達肝細胞和膽上皮細胞的標志物，細胞角蛋白CK7和CK19為膽上皮細胞的特異性標志；白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)和肝代謝酶細胞色素P450可作特異性標志物；細胞角蛋白CK8和CK18在肝實質細胞和膽上皮細胞都有表達。肝干細胞一般除了其特有的形態(tài)學外，常結合上述特有標志，通過免疫組織化學、流式細胞檢測和原位雜交等方法予以鑒定。

第二十二頁，共50頁。肝干細胞的可塑性雙潛能卵圓形細胞不僅能分化為肝細胞和膽上皮細胞，當分別移植到胰腺和十二指腸時，還能跨組織分化為胰腺細胞和腸上皮細胞，表明肝干細胞在適當?shù)奈h(huán)境中能被誘導分化為內胚層的其他組織細胞，目前，還未見有跨胚層分化的直接例證。卵圓形細胞異常分化或分化突然停止有可能發(fā)生肝細胞癌。

第二十三頁，共50頁。4、骨骼肌干細胞肌肉的生長、更新和修復是由衛(wèi)星細胞（satellitecells）介導的，一般認為這就是骨骼肌干細胞。近年的研究表明，從肌肉分離的干細胞不僅能分化出肌肉，還能產生血液細胞成分。骨骼肌干細胞不僅存在于骨骼肌組織，而且具有分化的可塑性，甚至跨越胚層分化為肝細胞和神經細胞。第二十四頁，共50頁。成體干細胞的體外培養(yǎng)和特性骨髓間質干細胞造血干細胞神經干細胞第二十五頁，共50頁。1、骨髓間質干細胞（MSC）近年的研究已表明間質干細胞（MSC）能向軟骨、骨、脂肪、造血基質和神經元樣等細胞分化，使其首選為組織工程中的種子細胞。最初，用含血清的完全培養(yǎng)基或無血清化學限定性培養(yǎng)液使孵化4.5日齡雞胚肢芽的骨髓MSC原代培養(yǎng)獲得成功。隨后，大鼠、人和兔的骨髓MSC原代和繼代培養(yǎng)也有進展。第二十六頁，共50頁。大鼠骨髓MSC細胞體外培養(yǎng)取大鼠股骨，Tyrode`s液洗滌干凈用注射器吸10ml含血清的DMEM－LG培養(yǎng)液，將針頭插入除去骨骺后的股骨一端的骨髓腔，注入培養(yǎng)液從骨的另一端收集，反復抽吸，打散成細胞懸液調節(jié)有核細胞密度至5×107個/ml，接種到直徑為10mm的培養(yǎng)皿中37℃,5%CO2每隔3－4天換液一次，一般經2周左右可形成一些較大的細胞克隆第二十七頁，共50頁。體外生長特性原代培養(yǎng)物中多為成纖維樣細胞，紅細胞在此培養(yǎng)液中不能存活，而且不貼壁，通過換液而洗除。MSC中混雜的巨噬細胞、單核細胞，造血細胞等，由于它們的貼壁黏附能力不同，通過調整胰蛋白酶－EDTA的消化時間，保證在短暫消化時間內，使MSC與培養(yǎng)皿底脫離，而其他細胞仍貼附于培養(yǎng)皿底，從而使MSC在傳代期間進一步得到純化。第二十八頁，共50頁。MSC生長呈長梭形，成索密集排列。鑒定包括人在內的MSC的直接標志物SH2＋、SH3＋、CD44＋、CD71＋、CD94＋、CD124＋、CD14－、CD34－等。還可通過檢測它們成骨和成軟骨能力予以鑒定。第二十九頁，共50頁。2、造血干細胞胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)造血功能的組織是卵黃囊。胎兒出生前，胚胎肝臟是主要的造血組織，內含較多的造血干細胞，人胚發(fā)育至6個月后，骨髓組織造血功能逐漸明顯，而肝臟的造血功能逐漸減少。出生后，造血細胞主要存在于紅髓內。第三十頁，共50頁。紅髓：脾臟白髓周圍的區(qū)域，包括脾索和脾竇，脾索含大量B細胞、漿細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，由脾索圍成的脾竇內充滿血液。脾索和脾竇壁的巨噬細胞能吞噬和清除血液中衰老紅細胞和病原體。第三十一頁，共50頁。脾臟內部可分為紅髓及白髓。紅髓的主要功能是過濾和儲存血液，，由脾索及血竇組成，但因為其不含輸入淋巴管，所以脾臟不能過濾淋巴的功能。而白髓的主要功能則為對抗外來微生物及感染。

在正常狀態(tài)下一般摸不到脾臟，如果仰臥或右側臥位可能觸摸到脾臟邊緣即可認為是脾大，近年來B超在臨床的廣泛應用：

第三十二頁，共50頁。引起脾大的原因有：（1）感染性脾大。各種急、慢性感染如傷寒、副傷寒、黑熱病、血吸蟲病、瘧疾、病毒性肝炎、敗血癥、晚期梅毒等.（2）郁血性脾腫大。斑替氏綜合征、肝硬化、慢性心力衰竭致心原性肝硬化、慢性縮窄性心包炎、門靜脈或脾靜脈血栓形成。（3）增生性脾大。見于某些血液病如白血病、溶血性貧血、惡性淋巴瘤等。（4）其它。脾臟惡性腫瘤較罕見、脾臟囊腫、播散性紅斑狼瘡、皮肌炎、結節(jié)性多動脈炎、高雪氏病等。因脾臟大原因較復雜，除少數(shù)人為生理性外，都應在醫(yī)生指導下尋找病因，并要定期復查。第三十三頁，共50頁。3、神經干細胞神經干細胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個基本條件：①具有永生化特性即在細胞周期內不斷地復制增殖，產生大量子代細胞；②具有神經干細胞世系遺傳顯性特性即神經干細胞表型，在適當?shù)沫h(huán)境和條件下，它可分化為神經元和包括星形細胞、少突膠質細胞及Schwann`s細胞等在內的神經膠質細胞。第三十四頁，共50頁。體外培養(yǎng)建系早期胚胎的神經管和神經嵴或胎兒的腦組織是體外培養(yǎng)神經干細胞的最理想材料來源。首要問題是維持其分裂、增殖的能力?；九囵B(yǎng)基是一種特定的N2液。添加因子有葡萄糖、人胰島素、人轉鐵蛋白、黃體酮、二氫氯丁二胺、硒酸鈉、谷氨酰胺和肝素等。細胞傳代時，用手術刀片沿著神經球中間的縱橫軸切割成四等份，則神經干細胞可維持穩(wěn)定而快速的生長。第三十五頁，共50頁。生物學特性未分化的神經干細胞一般每隔7－10天細胞數(shù)可增加一倍，一般可傳35代，歷時一年，在這期間，細胞系可分化為神經元、少突神經膠質細胞和星形細胞等多能性。第三十六頁，共50頁。成體干細胞研究中的問題限制成體干細胞應用的主要因素是來源困難成體干細胞在體外傳代中端粒酶活性很快下降，可能是造成成體干細胞不能在體外大量擴增的主要原因.

第三十七頁，共50頁。1、異質性2、干細胞所處環(huán)境3、可塑性的調控4、分化細胞的功能5、體外增殖第三十八頁，共50頁。1、異質性（heterogeneity）指由于不同遺傳機制而產生相同或類似的表現(xiàn)型。異質性在某種程度上是干細胞固有的特性。成體干細胞的可塑性是否與干細胞異質性直接相關？一種干細胞與其組織來源及歸宿之間的確切關系？等，還需要深入的研究。第三十九頁，共50頁。2、干細胞所處環(huán)境環(huán)境的信號對干細胞的分化命運有著重要影響。如，小鼠造血干細胞和胰腺干細胞都能分化出肝細胞，并能修復小鼠受損的肝組織，但，移植造血干細胞和胰腺干細胞對修復小鼠受損的肝組織的效果遠遠比移植成熟肝干細胞本身差得多。干細胞在接受亞致死劑量照射等異常環(huán)境下被觀察到“可塑性”現(xiàn)象，人們還難以解釋。第四十頁，共50頁。3、可塑性調控外源性內源性體液因子、同種或異種細胞的接觸、細胞外基質等的作用大多數(shù)干細胞的可塑性研究是基于組織損傷而造成的微環(huán)境一般認為轉錄因子在其中起著重要的作用。尚在起步階段第四十一頁，共50頁。成體干細胞“可塑性”調控的解釋(4種)：①機體中存在著多種來源和不同分化方向的成體干細胞群體，能定向地向各自的組織來源的細胞分化；②機體中存在著一種多潛能的成體干細胞，在不同的微環(huán)境信號刺激下，可向不同組織的細胞方向分化；第四十二頁，共50頁。③特定組織來源的成體干細胞，除了向該組織的細胞分化外，在特殊信號的刺激下，可重新編程，繼續(xù)分化為其他類型的細胞；④某種成體干細胞與特定組織來源的干細胞發(fā)生融合，產生具有兩種細胞的遺傳物質且染色體數(shù)量也是正常細胞兩倍的“雜交細胞”，因而獲得了后者的分化潛能。第四十三頁，共50頁。4、分化細胞的功能檢測終末分化細胞的特定蛋白或標志物的表達，很少檢測終末分化細胞的功能，有些不同類型的細胞卻具有相同的標志。檢測到某種標志就證明該細胞或組織具有正常功能持有質疑，特別是干細胞的異質性和類型以及環(huán)境的復雜性使得人們對體外培養(yǎng)的干細胞移植入體內能否發(fā)揮預期功能表示懷疑。要確定供體干細胞的終末