雪蓮多糖的提取及分離純化工藝研究畢業(yè)論文

[30]。（3）熱效應(yīng)超聲過(guò)程中產(chǎn)生空化效應(yīng)，即在液體中產(chǎn)生氣泡和氣泡在超聲作用下的特殊作用。這些氣泡在經(jīng)歷稀疏相和壓縮相，氣泡生長(zhǎng)、收縮、再生長(zhǎng)、再收縮，經(jīng)多次周期性震蕩，最終以高速度崩裂，然后閉合，該過(guò)程會(huì)產(chǎn)生短暫的局部高溫、高壓。在這個(gè)過(guò)程中釋放的熱量可以有效促進(jìn)原料細(xì)胞內(nèi)部有效成分的擴(kuò)散作用附錄超聲輔助提取鬼箭羽葉中的蘆丁和槲皮素楊屹；張帆北京化工大學(xué)理學(xué)院，中國(guó)北京，100029，附錄超聲輔助提取鬼箭羽葉中的蘆丁和槲皮素楊屹；張帆北京化工大學(xué)理學(xué)院，中國(guó)北京，100029，摘要：本文對(duì)超聲輔助提取鬼箭羽葉中蘆丁和槲皮素的方法進(jìn)行了研究?？疾炝怂膫€(gè)對(duì)蘆丁和槲皮素的提取量的影響。優(yōu)化的最佳提取條件為：提取溶劑70％乙醇溶液，液固比40:1（V/W），提取時(shí)間3×30分鐘。對(duì)蘆丁和槲皮素的回收率和提取方法的重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明，超聲提取方法適用于從干燥的衛(wèi)矛中提取蘆丁和槲皮素。與傳統(tǒng)的方法相比，超聲波輔助提取是一種從衛(wèi)矛中提取蘆丁和槲皮素更有效的方法。同時(shí)，掃描電子顯微鏡（SEM）顯示，同浸漬法相比較，超聲處理能夠迅速的對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行破壁。1.簡(jiǎn)介中藥衛(wèi)矛植物的使用具有2000多年的歷史。蘆丁和槲皮素主要應(yīng)用于心臟和腎等器官疾病的治療[1]。具有抗菌和抗高血壓等生理活性作用。蘆丁和槲皮素都可由衛(wèi)矛植物的莖獲得，而且有相同的治療效力。因此從衛(wèi)矛植物中提取蘆丁和槲皮素是其重要來(lái)源。在傳統(tǒng)的方法，提取的蘆丁和槲皮素是通過(guò)加熱，煮沸或回流。這個(gè)程序的缺點(diǎn)是蘆丁和槲皮素在提取過(guò)程中發(fā)生電離損失，水解和氧化[3-5]。此外，該方法消耗了大量的溶劑和提取時(shí)間[6-8]。超聲提取是一種近年來(lái)新興的提取方法的，具有提高提取效率產(chǎn)量和縮短提取時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[9,10]。超聲波能夠使細(xì)胞破裂，顆粒變小，超聲波輻射作用到固體表面可增加固液接觸面積，從而使溶劑成分得到充分利用[11,12]。超聲波能提高有機(jī)物提取量的現(xiàn)象稱為空化作用。當(dāng)超聲波強(qiáng)度達(dá)到一定強(qiáng)度，擴(kuò)張循環(huán)能在液體中形成洞或微型氣泡。一旦形成，這些氣泡會(huì)吸收聲波的能量，由壓縮引起的壓力和溫度的上升導(dǎo)致氣泡的破裂，這會(huì)導(dǎo)致崩潰沖擊波傳遞通過(guò)溶劑，增加體系內(nèi)的大量轉(zhuǎn)移[13-15]。目前，超聲波以應(yīng)用于從植物中提取黃酮類化合物等[16]活性的化合物，碳?xì)浠衔颷17]，脂肪酸酯[18-20]，抗氧化劑[21]，類固醇[22]及蒽醌[23,24]。到目前為止，利用超聲從衛(wèi)矛中提取蘆丁和槲皮素，沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，使用超聲方法研究從干燥的衛(wèi)矛中提取蘆丁和槲皮素顯得有必要。本文對(duì)蘆丁和槲皮素的超聲提取條件進(jìn)行了研究和超聲波輔助提取的最佳條件確定。2.材料與方法2.1植物材料中國(guó)遼寧省提供的干燥衛(wèi)矛。對(duì)樣品進(jìn)行干燥（24小時(shí)，100度）和保存（60目）。樣品用之前存放在干燥的地方。2.2浸漬提取浸漬法：1g粉末原料，加入100毫升乙醇作為提取溶劑。該混合物放在室溫環(huán)境6小時(shí)，用攪拌機(jī)偶爾攪拌。然后，收集提取液上清，微孔過(guò)濾（0.45μm），高效液相色譜分析。2.3超聲輔助提取對(duì)于超聲輔助提取實(shí)驗(yàn)中使用的是KQ-100DB超聲儀器（中國(guó)昆山超聲波有限責(zé)任公司），尺寸為23.5×13.3×10.2厘米）。超聲時(shí)額定功率為100瓦，范圍是0–10。超聲提取過(guò)程在裝有2.0升水的超聲食儀器中進(jìn)行，水浴步驟如下：，在25ml的三角燒瓶中加入0.5g干燥的地上的莖和20ml的溶劑。然后將燒瓶部分浸入。保持水的循環(huán)，并保持恒定的溫度，以避免由于超聲引起的溫度上升。2.4分析儀器與方法安捷倫HPLC系統(tǒng)（型號(hào)1100，美國(guó)）構(gòu)造如下：系統(tǒng)控制器，G1311A泵，G1314A多波長(zhǎng)檢測(cè)器用于蘆丁和槲皮素的測(cè)定。色譜柱為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品EclipseXDB-C18（5μm，150×4.6mm）。高效液相色譜分析以甲醇-水-醋酸混合溶液（45:55:0.5，v/v）為流動(dòng)相，流速為1毫升/分鐘，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20μl。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。校準(zhǔn)曲線法用于蘆丁和槲皮素的HPLC分析。2.5掃描電鏡為了闡明超聲提取作用過(guò)程和了解超聲提取的機(jī)理，樣品在提取后進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）分析。將提取后的原料顆粒用鋁膠帶固定在樣品座，然后用EmitechK500X進(jìn)行鍍膜。所有的樣本都在高真空條件和20千伏電壓下用CambridegS250MK3掃描電鏡檢測(cè)。3．結(jié)果和討論3.1色譜結(jié)果圖1是標(biāo)準(zhǔn)品和超聲提取樣品的色譜圖，圖1A顯示標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁和槲皮素的出峰時(shí)間分別出現(xiàn)在4.5min和13.5min，圖1B是提取樣品的色譜圖。3.2溶劑和樣品液固比的影響一般來(lái)說(shuō)，大量的溶劑可有效的溶解成分，從而提高提取量。圖2顯示了溶劑量對(duì)超聲提取衛(wèi)矛中蘆丁和槲皮素的影響。結(jié)果表明，當(dāng)溶劑與樣品的液固比在20-40之間時(shí)，蘆丁和槲皮素的提取量和液固比成正比。因此，選擇液固比為40是最佳的。3.3乙醇濃度的影響超聲30分鐘乙醇濃度對(duì)萃取蘆丁和槲皮素的影響如圖3。蘆丁和槲皮素的提取量隨乙醇濃度增大而增加，直至乙醇濃度達(dá)到70％。這可能是由于極性比較接近，溶液中的水有助于增加溶質(zhì)溶劑接觸表面積[25]。因此，70％的乙醇水溶液提取被選為在下列研究溶劑。3.4提取時(shí)間的影響提取時(shí)間對(duì)蘆丁和槲皮素提取率的影響如圖4。結(jié)果表明，這兩種提取物的提取量很大程度上取決于提取時(shí)間。在超聲時(shí)，前30min蘆丁和槲皮素的提取率迅速提高，后90min萃取率增加緩慢。圖5顯示了樣品超聲90分鐘的情況，當(dāng)樣品超聲3次每次30分鐘，每次超聲前加入新的溶劑，此時(shí)的蘆丁和槲皮素提取率最高。當(dāng)樣本提取兩次，每次45分鐘，產(chǎn)量也比只提取了一次90分鐘的高。結(jié)論：在一個(gè)固定的90分鐘，超聲3次后的蘆丁和槲皮素提取量最佳?？紤]到上述結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化：乙醇水（70％）；液固比40/1（V/W），提取時(shí)間為3×30分鐘。3.5回收率和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)在上述優(yōu)化的條件下，對(duì)3個(gè)衛(wèi)矛粉末進(jìn)行蘆丁和槲皮素的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(見表1)。蘆丁和槲皮素的回收率分別為99.5％和100.3％。為了研究超聲輔助提取法對(duì)蘆丁和槲皮素的重現(xiàn)性，有五個(gè)樣品在優(yōu)化條件下進(jìn)行處理。結(jié)果表明蘆丁和槲皮素的提取量的重現(xiàn)性很好。3.6浸漬和超聲波之間的輔助提取的比較浸漬和超聲波輔助提取率的比較結(jié)果列于表2。超聲波輔助提取法有更高的應(yīng)用價(jià)值，而浸漬法應(yīng)用價(jià)值較低。在提取時(shí)間上，超聲波輔助提取的速度比浸漬快。從提取率來(lái)看，超聲波輔助提取更適合對(duì)活性成分的研究。3.7原料超聲提取后的結(jié)構(gòu)變化各種提取方法能夠引起衛(wèi)矛粉末結(jié)構(gòu)的物理變化。圖6a是未經(jīng)處理的樣品掃描電鏡顯微結(jié)構(gòu)，同圖6b（浸漬）、6c和6d（超聲波輔助提?。┨幚順悠返慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。在浸漬（圖6b），表面只有微小的破壞。圖6c和6d顯示了經(jīng)過(guò)超聲輔助提取后，樣品表面上有大量的縫隙結(jié)構(gòu)。干燥原材料提取過(guò)程涉及兩個(gè)階段：（i）將植物材料浸泡在溶劑中以促進(jìn)膨脹和水化過(guò)程；（ii）可溶性成分物質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散和滲透的過(guò)程轉(zhuǎn)移到溶劑中[26]。這表明，超聲波作用將改變細(xì)胞膜表面張力，在表面形成很多凹陷（圖6）。該細(xì)胞膜質(zhì)的變化可能導(dǎo)致樣品更容易破裂或崩潰。更重要的是，凹陷的破裂能夠促進(jìn)溶質(zhì)擴(kuò)散和滲透的過(guò)程。4結(jié)論對(duì)兩種蘆丁和槲皮素的提取工藝進(jìn)行了研究和比較。超聲輔助提取產(chǎn)量高，溶劑消耗少。最值得注意的是，使用超聲波，提取時(shí)間可大大縮短。用超聲波提取技術(shù)提取蘆丁和槲皮素效率很高。從掃描電鏡形貌觀察，這兩種方法似乎在植物表面引起不同的變化。超聲波照射樣品顯示植物表面又凹陷的出現(xiàn)，證實(shí)超聲波可容易的引起的樣品破裂或崩潰。1.6立題目的及意義目前國(guó)內(nèi)外對(duì)雪蓮開發(fā)、利用主要在以雪蓮黃酮為主要成分，已研制開發(fā)一系列重要中成藥和保健品。其基礎(chǔ)研究主要集中對(duì)雪蓮黃酮在調(diào)節(jié)血脂、抗氧化等方面都有明顯療效，對(duì)雪蓮多糖僅有少量報(bào)道,并且雪蓮多糖現(xiàn)有的研究也只停留在對(duì)資源的挖掘和粗提物的生理活性研究方面。雪蓮是傳統(tǒng)的藥用植物，具有很高的利用價(jià)值，但是由于生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，以及人類掠奪性的采挖，以造成了這一寶貴物種資源枯竭，本文針對(duì)野生雪蓮及組培雪蓮所含的多糖成分進(jìn)行超聲法提取及優(yōu)化的研究，為雪蓮有用成分的提取提供了理論依據(jù)，為合理利用雪蓮資源奠定了基礎(chǔ)。第二章雪蓮多糖的提取方法確定2.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝科器研究所電子分析天平上海天平儀器廠電熱恒溫水浴鍋上虞市儀器廠臺(tái)式離心機(jī)分光光度計(jì)2.1.2實(shí)驗(yàn)材料及試劑組培2-3年雪蓮，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，6%苯酚，濃硫酸，考馬斯亮藍(lán)G-250，牛血清蛋白，0.15mol\lNaCl溶液。2.2提取方法2.2.1恒溫水浴加熱法稱取粉碎好的組培2-3年雪蓮樣品2g，加入200ml蒸餾水。在85℃的水浴鍋中恒溫水浴加熱3h,水浴完畢后離心[5000r10min]取上清液，加水定容至200ml，待測(cè)。2.2.2超聲波法稱取粉碎好的組培2-3年雪蓮樣品20g，加入400ml蒸餾水，攪拌均勻后放于提取容器中，超聲15min[600w1.5:0.5(s)]，過(guò)濾分離出上清液1和殘?jiān)?；將殘?jiān)俅渭尤?00ml蒸餾水，超聲15min[600w1.5:0.5(s)]，過(guò)濾分離出上清液2；將兩次上清液混合，待測(cè)。超聲提取實(shí)驗(yàn)裝置見圖3.1。圖3.1超聲波強(qiáng)化提取實(shí)驗(yàn)裝置圖1.Temperaturecontroller2.Temperatureprobe3.Ultrasonicgenerator4.Ultrasonicconverter5.Extract6.Waterbath2.2多糖含量的測(cè)定測(cè)定方法主要采用苯酚-硫酸法。2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1、溶液的配制（1）6%苯酚溶液的配制：稱取苯酚6g，置于100ml棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，放入冰箱中備用。（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取葡萄糖25mg，加蒸餾水溶解，定容至250ml，得到濃度為1.0mg\ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、操作方法（1）稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度；（2）分別取0.4,0.6,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8ml，各以補(bǔ)水至2.0ml；（3）加入6%苯酚1.0ml。濃硫酸5.0ml，靜置10min；（4）搖勻，室溫放置20min后于490nm測(cè)光密度；（5）以2.0ml水按上述操作做空白對(duì)照；（6）橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、數(shù)據(jù)與曲線項(xiàng)目數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（ml）1.01.8吸光度值0.1110.2320.3310.4380.5380.6740.7630.8702.2.2樣品多糖濃度的測(cè)定吸取樣品液1.0ml，按上述操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。2.3考馬斯亮藍(lán)G-250法繪制蛋白制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法主要采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1、溶液的配制（1）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，蒸餾水稀釋至1000ml，抽濾，避光保存。（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:50mg純牛血清蛋白用0.15mol\lNaCl定容至500ml，配置成100ug\ml蛋白溶液。2、操作步驟（1）分別取牛血清蛋白溶液0.2，0.4，0.6，0.8,1.0ml置于試管中，補(bǔ)0.15mol\lNaCl至1.0ml；（2）加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0ml，立搖勻，2~5min后于595nm處測(cè)吸光度；（3）以1.0ml0.15mol\lNaCl作空白對(duì)照；（4）以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液作橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、數(shù)據(jù)與曲線項(xiàng)目數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）20406080100吸光度值0.1420.2360.3200.3940.4612.3.2樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定吸取樣品液1.0ml，按上述操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。2.4實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析2.4.1多糖含量的測(cè)定數(shù)據(jù)項(xiàng)目恒溫水浴加熱法提取的上清液稀釋10倍超聲法提取的上清液稀釋10倍樣品體積（ml）1.01.0吸光度值\490nm0.4870.171多糖濃度（mg\ml）0.8650.400多糖百分含量（%）3.0284.0002.4.2蛋白質(zhì)含量的測(cè)定項(xiàng)目恒溫水浴加熱法提取的上清液超聲法提取的上清液樣品體積（ml）1.01.0吸光度值\595nm0.5190.179蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）87.326.8蛋白質(zhì)百分含量（%）0.2730.2682.4.3小結(jié)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果表明：超聲波法對(duì)雪蓮多糖的提取率雖然比恒溫水浴加熱法稍微偏低，但操作簡(jiǎn)單且能大批量提??；恒溫水浴加熱法操作時(shí)間太長(zhǎng)，并且只能適用于小批量提取。所以本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取雪蓮多糖。第三章雪蓮超聲提取工藝優(yōu)化3.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料3.1.1實(shí)驗(yàn)儀器JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝科器研究所電子分析天平FA2004上海天平儀器廠Tyler標(biāo)準(zhǔn)篩上虞市儀器廠分光光度計(jì)旋蒸儀紅外光譜儀高效液相色譜儀3.1.2實(shí)驗(yàn)材料及溶劑組培2-3年雪蓮，野生雪蓮，3%三氯乙酸，氯仿，正丁醇，D72樹脂，D113樹脂，雙氧水，活性炭，X-5樹脂，NKA樹脂，ADS-7樹脂，ADS-8樹脂，乙醇(分析純)，3.2樣品溶液的制備稱取雪蓮樣品100g加入3.0L蒸餾水，超聲20min[600w1.5:0.5(s)]，過(guò)濾分離出上清液1和殘?jiān)?；將殘?jiān)俅渭尤?.03.3雪蓮多糖脫蛋白方法方法的比較取等量雪蓮提取液，在相同條件下用三氯乙酸法、Seveage法、樹脂法進(jìn)行脫蛋白，測(cè)溶液的蛋白損失率和多糖損失率，確定最適脫蛋白方法。3.3.1三氯乙酸法除蛋白在在多糖溶液中滴加3%三氯乙酸，直至溶液不再繼續(xù)混濁為止；5~10℃放置過(guò)夜，離心[5000r15min]除去膠狀沉淀即得無(wú)蛋白質(zhì)的多糖溶液。項(xiàng)目樣品體積（ml）20202020202020三氯乙酸量（ml）0123456吸光度值\595nm0.5190.3240.2380.1860.1620.1540.142蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）111.8063.0541.5528.5522.5520.5517.55蛋白質(zhì)損失率（%）43.6062.8474.4679.8381.6284.30吸光度值\490nm（稀釋5倍）0.457×20.6430.5980.5650.5370.5260.516多糖質(zhì)量（mg）0.8210.6210.5900.5640.5430.5350.528多糖損失率（%）24.3627.8631.3033.8634.8435.693.3.2Seveage法除蛋白按多糖水溶液1\5~1\4體積加入氯仿，再加入氯仿體積1\5的正丁醇，劇烈振搖20min；當(dāng)多糖的水溶液用率方針要成乳化液時(shí)，蛋白質(zhì)變性成膠性蛋白質(zhì)；效率不高，一般要重復(fù)5次以上，才能除盡蛋白質(zhì)；為加速蛋白質(zhì)的變性，最好用PH4~5的緩沖液代替。項(xiàng)目重復(fù)次數(shù)0123456789吸光度值\595nm0.5850.5190.4900.4640.4400.4240.4020.3870.3800.370蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）128.3111.8104.698.6092.0588.4584.6578.8077.0574.55蛋白質(zhì)損失率（%）12.8618.4718.4728.2531.0634.0438.5839.9541.89吸光度值\490nm（稀釋10倍）0.5790.5560.4890.4670.4310.4130.4000.3900.3720.356多糖質(zhì)量（mg）1.0000.9660.8680.8320.7840.7560.7370.7220.6960.672多糖損失率（%）3.413.216.821.624.426.327.830.4樹脂法除蛋白取等量D72和D113樹脂，先水洗，再用1%的NaOH溶液堿洗，水洗，再用1%HCl溶液酸洗，再水洗至中性，再分別加入等量的雪蓮提取液，放置搖床搖至過(guò)夜。項(xiàng)目原液D72樹脂D113樹脂吸光度值\595nm0.5650.2150.295蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）123.335.8055.80蛋白質(zhì)損失率（%）70.9754.74吸光度值\490nm（稀釋10倍）0.5760.2220.218多糖質(zhì)量（mg）0.9960.4750.469多糖損失率（%）52.3152.913.3.4小結(jié)關(guān)于三種脫蛋白方法的比較：三氯乙酸法:脫蛋白效果不明顯，需進(jìn)行多次重復(fù)處理，對(duì)試劑消耗較大；雖然每次處理對(duì)多糖損失不是很大，但由于重復(fù)次數(shù)較多，累積后對(duì)多糖的損失量也較大；由于重復(fù)次數(shù)一般在10次以上，故總體處理時(shí)間較長(zhǎng)。三氯乙酸法：脫蛋白效果比較明顯，但對(duì)多糖的損失也較大；由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入三氯乙酸試劑，最后所得的溶液中含有該試劑，需要進(jìn)行除雜處理，此過(guò)程比較復(fù)雜。樹脂吸附法：脫蛋白效果明顯，對(duì)多糖損失有一定影響，但整個(gè)過(guò)程不會(huì)引人新的雜質(zhì)；另外樹脂經(jīng)過(guò)處理后能重復(fù)使用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：D72樹脂的脫蛋白效果比D113樹脂好?？偨Y(jié)：經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D72樹脂吸附脫蛋白法為最佳的脫蛋白方法。3.4雪蓮多糖脫色方法方法的比較取等量雪蓮提取液，在相同條件下用雙氧水脫色法、活性炭吸附脫色法、樹脂法進(jìn)行脫色，比較顏色的差異，在480nm處測(cè)吸光度，確定脫色效果。同時(shí)測(cè)溶液的蛋白損失率和多糖損失率，確定最適脫色方法。3.4.1四種樹脂脫色方法處理后樣品溶液脫色效果及蛋白和多糖的損失率1、脫色效果比較取等量X-5樹脂，NKA樹脂，ADS-7樹脂，ADS-8樹脂，用95%以、乙醇洗至澄清，再水洗2-3遍，再分別取等量的樣品加入其中，振搖2-3h。比較個(gè)樣品的顏色變化，并在480nm處測(cè)其吸光度。圖3.2（從左起）原液，NKA樹脂，X-5樹脂，ADS-7樹脂，ADS-8樹脂2、480nm處測(cè)其吸光度及蛋白質(zhì)和多糖損失率項(xiàng)目原液NKA樹脂X-5樹脂ADS-7樹脂ADS-8樹脂吸光度值\480nm0.7940.4200.4890.3880.468吸光度值\595nm0.5650.3820.3650.3720.389蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）123.3077.5573.3075.0579.30蛋白質(zhì)損失率（%）37.1040.5539.1335.69吸光度值\490nm（稀釋10倍）0.5670.4210.4090.4350.419多糖質(zhì)量（mg）0.9960.7680.7500.7880.765多糖損失率（%）22.8924.7020.88雙氧水脫色方法處理后樣品溶液1、脫色效果比較取等量樣品溶液調(diào)PH至9.0，分別加入30%雙氧水適量，使其溶度分別為0.5%，1.0%，1.5%，然后40℃保溫超聲15min。圖3.3（從左起）原液，0.5%雙氧水，1.0%雙氧水，1.5%雙氧水2、480nm處測(cè)其吸光度及蛋白質(zhì)和多糖損失率項(xiàng)目原液0.5%雙氧水1.0%雙氧水1.5%雙氧水吸光度值\480nm0.7940.6690.6380.606吸光度值\595nm0.5650.5250.5430.511蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）123.30113.30117.80109.80蛋白質(zhì)損失率（%）8.114.4610.95吸光度值\490nm（稀釋10倍）0.5670.5420.5180.551多糖質(zhì)量（mg）0.9960.9460.9100.959多糖損失率（%）5.028.633.713.4.3活性炭脫色方法處理后樣品溶液1、脫色效果比較取等量樣品溶液，分別加入活性炭適量，使其溶度分別為0.5%，1.0%，1.5%，然后40℃保溫超聲15min。圖3.4（從左起）原液，0.5%活性炭，1.0%活性炭，1.5%活性炭2、480nm處測(cè)其吸光度及蛋白質(zhì)和多糖損失率項(xiàng)目原液0.5%活性炭1.0%活性炭1.5%活性炭吸光度值\480nm0.7940.7820.8600.972吸光度值\595nm0.5650.5340.5210.541蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）123.30115.55113.30117.30蛋白質(zhì)損失率（%）6.298.924.87吸光度值\490nm（稀釋10倍）0.5670.5310.5450.519多糖質(zhì)量（mg）0.9960.9290.9500.912多糖損失率（%）6.734.628.433.4.3小結(jié)關(guān)于三種脫蛋白方法的比較：1、樹脂吸附法：脫色效果明顯，在脫色的同時(shí)還能脫去一部分蛋白，利于多糖的純化的進(jìn)行，同時(shí)對(duì)多糖損失有一定影響；但整個(gè)過(guò)程不會(huì)引人新的雜質(zhì)；另外樹脂經(jīng)過(guò)處理后能重復(fù)使用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：四種樹脂對(duì)溶液蛋白和多糖的影響差不多；其中，ADS-7樹脂的脫色效果比其它三種樹脂好，最為明顯。2、雙氧水脫色法：脫色效果不明顯；由于30%雙氧水具有強(qiáng)氧化性，操作過(guò)程中要注意安全；同時(shí)，由于加入雙氧水試劑，最后所得的溶液中含有該試劑，需要進(jìn)行除雜處理，此過(guò)程比較復(fù)雜。3、活性炭吸附脫色法：脫色效果不明顯；在后面的分離操作中，有少量的活性炭顆粒仍殘留在溶液中，無(wú)法完全分離。總結(jié)：經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樹脂吸附法脫色效果最佳，其中，ADS-7樹脂的脫色效果比其它三種效果更佳。所以，選擇ADS-7樹脂吸附脫色法進(jìn)行脫色。3.5雪蓮多糖提取工藝優(yōu)化3.5.1D72樹脂量的確定取等量雪蓮提取液，在相同條件下用不同量的D72樹脂進(jìn)行脫蛋白，測(cè)溶液的蛋白損失率和多糖損失率，確定D72樹脂的量。項(xiàng)目原液第一次脫蛋白第二次脫蛋白樣品溶液（ml）4040404040404040404040D72樹脂量（ml）05101520255＋510＋1015＋1520＋2025＋25吸光度值\595nm0.5190.1800.1520.1360.1200.1130.1510.1260.1110.1040.100蛋白質(zhì)濃度（ug\ml）111.8027.0520.0516.0512.0510.3019.8013.559.808.057.05蛋白質(zhì)損失率（%）75.8182.0785.6489.2290.7926.8032.4238.9433.2031.55吸光度值/490nm（稀釋5倍）0.475×20.8910.8020.7120.6450.5510.7370.6890.6140.5380.467多糖質(zhì)量（mg）0.8210.7290.6640.5980.5490.4790.6160.5810.5260.4700.418多糖損失率（%）11.2119.1227.1633.1341.6615.5012.5012.0414.3912.733.6利用無(wú)水乙醇提取多糖第四章雪蓮不同部位成分分析植物不同部位次生代謝產(chǎn)物組成及含量不盡相同，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜，分別測(cè)定雪蓮不同部位中綠原酸、紫丁香干、蘆丁的含量，以便為更好的利用雪蓮資源提供科學(xué)依據(jù)。4.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料4.1.1實(shí)驗(yàn)儀器120D超聲波發(fā)生器北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司高速萬(wàn)能粉碎機(jī)北京中興偉業(yè)儀器有限公司電子分析天平FA2004上海天平儀器廠Tyler標(biāo)準(zhǔn)篩上虞市儀器廠其余儀器同.2實(shí)驗(yàn)材料及溶劑新疆雪蓮，乙醇(分析純)，乙酸(分析純)，甲醇、乙腈(色譜純)。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1原料準(zhǔn)備將雪蓮原料按照花、莖、葉、全株分類，粉碎并過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩，收集備用。4.2.2樣品制備方法5g雪蓮粉，加入70%乙醇200mL，超聲40min，離心：上清=1\*GB3①、沉淀；沉淀加入70%乙醇200mL，超聲40min，離心：上清=2\*GB3②、沉淀；上清=1\*GB3①上清=2\*GB3②合并，取樣8~10mL，待測(cè)。4.2.3反相高效液相色譜條件色譜為XTerraMSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0~25min~50min；VA:VB為5:95~20:80，分析時(shí)間為50min，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為15μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，柱溫為38℃。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析4.3.1雪蓮各部位HPLC色譜圖（1）雪蓮花圖4.1雪蓮花HPLC色譜圖（2）雪蓮莖圖4.2雪蓮莖HPLC色譜圖（3）雪蓮葉圖4.3雪蓮葉HPLC色譜圖（4）雪蓮全株圖4.4雪蓮全株HPLC色譜圖4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果由HPLC色譜圖，計(jì)算出雪蓮各部位成分提取率，結(jié)果匯總?cè)缦卤?.5。表4.5雪蓮各部位成分提取率綠原酸紫丁香苷蘆丁花1.33%0.012%0.13%莖0.31%0.027%0.10%葉0.24%0.017%0.35%全株1.76%0.051%0.56%4.3.3結(jié)果分析分析全株野生雪蓮，綠原酸的提取率最高，為1.76%，紫丁香苷的提取率最低，為0.051%，蘆丁的提取率居中，為0.56%。分析單個(gè)藥用成分，綠原酸在花中提取率最高，為1.33%，紫丁香苷在莖中提取率最高，0.027%，蘆丁在葉中提取率最高，為0.35%。4.4小結(jié)本章主要檢測(cè)了綠原酸、紫丁香苷、蘆丁在雪蓮各部位的含量，為野生新疆雪蓮有效成分的利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第五章總結(jié)及展望5.1總結(jié)本文研究了雪蓮中綠原酸、紫丁香苷、蘆丁的提取方法的優(yōu)化條件，采用超聲強(qiáng)化提取的方法大大提高了功率，縮短了提取時(shí)間，節(jié)省了提取溶劑。研究結(jié)果可以為雪蓮資源的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)，為雪蓮成分的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本論文的主要研究結(jié)果如下：1、建立了綠原酸、紫丁香苷、蘆丁的反相高效液相色譜分析檢測(cè)方法：色譜為XTerraMSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0-25min-50min；VA:VB為5:95-20:80，分析時(shí)間為50min，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為15μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，柱溫為38℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及精密度，可用于綠原酸、紫丁香苷、蘆丁的快速定量分析檢測(cè)。2、選擇超聲強(qiáng)化法提取綠原酸、紫丁香苷、蘆丁，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取條件。在物料80目、53.6%乙醇、液固比32.2:1、超聲提取32.4min，占空比為1.5s/0.5s的條件下，綠原酸、紫丁香苷、蘆丁的提取率可分別達(dá)到0.67%、0.047%、0.31%，接近實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)最高值。3、通過(guò)分別測(cè)定雪蓮不同部位中綠原酸、紫丁香干、蘆丁的含量，可知：分析全株野生雪蓮，綠原酸的提取率最高，為1.76%，紫丁香苷的提取率最低，為0.051%，蘆丁的提取率居中，為0.56%。分析單個(gè)藥用成分，綠原酸在花中提取率最高，為1.33%，紫丁香苷在莖中提取率最高，0.027%，蘆丁在葉中提取率最高，為0.35%。5.2展望1、對(duì)雪蓮提取方法進(jìn)行進(jìn)一步的摸索。2、學(xué)習(xí)并掌握雪蓮提取液的濃縮實(shí)驗(yàn)方法。3、通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，學(xué)習(xí)雪蓮藥用成分的分析純化。致謝本論文是在中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物細(xì)胞工程及天然產(chǎn)物課題組完成的。首先要感謝我的導(dǎo)師徐春明老師，在我做論文期間給我的指導(dǎo)和關(guān)心，為我順利完成本科論文提供了幫助。其次要感謝姚凌云師兄，畢業(yè)設(shè)計(jì)是在他的悉心指導(dǎo)下完成的，從畢業(yè)設(shè)計(jì)的選題構(gòu)思到修改成文每個(gè)環(huán)節(jié)都傾注著心血，尤其感謝姚師兄長(zhǎng)期以來(lái)在試驗(yàn)上對(duì)我耐心的指導(dǎo)和幫助。研究室中嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、扎實(shí)的工作作風(fēng)及融洽的團(tuán)隊(duì)氛圍對(duì)我的思維方式和處事方法產(chǎn)生了積極的影響。在論文完成的過(guò)程中，還要感謝趙兵、袁曉凡、王曉東老師的無(wú)私指導(dǎo)，在此向他們表示衷心的感謝！另外要感謝在生化試驗(yàn)室的孫健、王雪、王麗衛(wèi)、趙慶生、趙倩、孔德柱等師兄師姐的幫助，每當(dāng)我在實(shí)驗(yàn)室中遇到一些棘手的問(wèn)題時(shí)，他們總會(huì)施予援手。最后，要感謝和我同組的索云棋、王巖、李子辰同學(xué)，大家共同幫助，一起進(jìn)步，團(tuán)結(jié)一心，并最終順利完成了畢業(yè)設(shè)計(jì)。除此之外，感謝北京工商大學(xué)四年來(lái)對(duì)我的教育，感謝中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為畢業(yè)設(shè)計(jì)所提供的實(shí)驗(yàn)條件。參考文獻(xiàn)基于C8051F單片機(jī)直流電動(dòng)機(jī)反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機(jī)MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對(duì)良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機(jī)溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機(jī)的通用控制模塊的研究基于單片機(jī)實(shí)現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機(jī)控制的二級(jí)倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強(qiáng)型51系列單片機(jī)的TCP/IP協(xié)議棧的實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的蓄電池自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機(jī)的作物營(yíng)養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機(jī)的交流伺服電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機(jī)的泵管內(nèi)壁硬度測(cè)試儀的研制基于單片機(jī)的自動(dòng)找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機(jī)的液壓動(dòng)力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機(jī)實(shí)現(xiàn)一種基于單片機(jī)的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機(jī)的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機(jī)的噴油泵試驗(yàn)臺(tái)控制器的研制基于單片機(jī)的軟起動(dòng)器的研究和設(shè)計(jì)基于單片機(jī)控制的高速快走絲電火花線切割機(jī)床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機(jī)的機(jī)電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機(jī)的智能手機(jī)充電器基于單片機(jī)的實(shí)時(shí)內(nèi)核設(shè)計(jì)及其應(yīng)用研究基于單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的煙氣二氧化硫濃度檢測(cè)儀的研制基于微型光譜儀的單片機(jī)系統(tǒng)單片機(jī)系統(tǒng)軟件構(gòu)件開發(fā)的技術(shù)研究基于單片機(jī)的液體點(diǎn)滴速度自動(dòng)檢測(cè)儀的研制基于單片機(jī)系統(tǒng)的多功能溫度測(cè)量?jī)x的研制基于PIC單片機(jī)的電能采集終端的設(shè)計(jì)和應(yīng)用基于單片機(jī)的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機(jī)單片機(jī)控制系統(tǒng)的研制基于單片機(jī)的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機(jī)的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機(jī)的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機(jī)控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機(jī)的多生理信號(hào)檢測(cè)儀基于單片機(jī)的電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)Pico專用單片機(jī)核的可測(cè)性設(shè)計(jì)研究基于MCS-51單片機(jī)的熱量計(jì)基于雙單片機(jī)的智能遙測(cè)微型氣象站MCS-51單片機(jī)構(gòu)建機(jī)器人的實(shí)踐研究基于單片機(jī)的輪軌力檢測(cè)基于單片機(jī)的GPS定位儀的研究與實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機(jī)系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機(jī)的時(shí)控和計(jì)數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機(jī)和CPLD的粗光柵位移測(cè)量系統(tǒng)研究單片機(jī)控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機(jī)應(yīng)用能力的探究基于單片機(jī)控制的自動(dòng)低頻減載裝置研究基于單片機(jī)控制的水下焊接電源的研究基于單片機(jī)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機(jī)的氚表面污染測(cè)量?jī)x的研制基于單片機(jī)的紅外測(cè)油儀的研究96系列單片機(jī)仿真器研究與設(shè)計(jì)基于單片機(jī)的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機(jī)的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)基于MSP430單片機(jī)的電梯門機(jī)控制器的研制基于單片機(jī)的氣體測(cè)漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機(jī)的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機(jī)和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測(cè)技術(shù)研究基于單片機(jī)的膛壁溫度報(bào)警系統(tǒng)設(shè)計(jì)基于AVR單片機(jī)的低壓無(wú)功補(bǔ)償控制器的設(shè)計(jì)基于單片機(jī)船舶電力推進(jìn)電機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)基于單片機(jī)網(wǎng)絡(luò)的振動(dòng)信號(hào)的采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的大容量數(shù)據(jù)存儲(chǔ)技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機(jī)的疊圖機(jī)研究與教學(xué)方法實(shí)踐基于單片機(jī)嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實(shí)現(xiàn)基于AT89S52單片機(jī)的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的多道脈沖幅度分析儀研究機(jī)器人旋轉(zhuǎn)電弧傳感角焊縫跟蹤單片機(jī)控制系統(tǒng)基于單片機(jī)的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用研究基于單片機(jī)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)通信研究與應(yīng)用基于PIC16F877單片機(jī)的莫爾斯碼自動(dòng)譯碼系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的模糊控制器在工業(yè)電阻爐上的應(yīng)用研究基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究與開發(fā)基于Cygnal單片機(jī)的μC/OS-Ⅱ的研究基于單片機(jī)的一體化智能差示掃描量熱儀系統(tǒng)研究基于TCP/IP協(xié)議的單片機(jī)與Internet互聯(lián)的研究與實(shí)現(xiàn)變頻調(diào)速液壓電梯單片機(jī)控制器的研究基于單片機(jī)γ-免疫計(jì)數(shù)器自動(dòng)換樣功能的研究與實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的倒立擺控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)單片機(jī)嵌入式以太網(wǎng)防盜報(bào)警系統(tǒng)基于51單片機(jī)的嵌入式