發(fā)酵過程控制

關于發(fā)酵過程控制第1頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)發(fā)酵過程工藝控制的目的、研究的方法和層次一發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第2頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月1、分批發(fā)酵簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時間變化。第3頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期第4頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月1、比生長速率若細胞物質(zhì)或細胞數(shù)目增長一倍的時間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速率增長，可用數(shù)學模型來描述。（1）

（2）

式（1）表明，細胞物質(zhì)隨時間的增加而增加式（2）表明，細胞數(shù)目隨時間的增加而增加第5頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月

若μ為常數(shù)，則：

對式（1）積分得：

在大多數(shù)情況下，生長是以物質(zhì)的增加衡量的，因而得到應用。

此式可在△t=td（td為倍增時間）時求得，td即在時所需時間，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

為比生長速率，單位是h-1。第6頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月

例題：某微生物的＝0.125h-1，求td。第7頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物生長分為：遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和死亡期在遲滯期，菌體沒有分裂只有生長，因為當菌種接種入一個新的環(huán)境，細胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋，這時細胞不能分裂。當細胞內(nèi)的與細胞分裂相關的物質(zhì)濃度達到一定程度，細胞開始分裂，這時細胞生長很快，比生長速率幾近常數(shù)。這個時期稱為對數(shù)生長期第8頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月隨著細胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物減少，廢物積累，導致細胞生長速率下降，進入減速期和穩(wěn)定期。最后當細胞死亡速率大于生成速率，進入死亡期對于初級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累，而次級代謝產(chǎn)物則在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。第9頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點產(chǎn)率低，不適于測定動力學數(shù)據(jù)第10頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月2、補料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導致的發(fā)酵過早結束的缺點。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多。第11頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月補料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應；可以通過補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機會第12頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月3、半連續(xù)培養(yǎng)在補料分批培養(yǎng)的基礎上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大第13頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月4、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。第14頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動力學缺點菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。第15頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月二發(fā)酵過程工藝控制的目的有一個好的菌種以后要有一個配合菌種生長的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來目標是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率第16頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點菌種本身的代謝特點生長速率、呼吸強度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關性溫度、pH、滲透壓、離子強度、溶氧濃度、剪切力等第17頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物代謝是一個復雜的系統(tǒng)，它的代謝呈網(wǎng)絡形式，比如糖代謝產(chǎn)生的中間物可能用作合成菌體的前體，可能用作合成產(chǎn)物的前體，也可能合成副產(chǎn)物，而這些前體有可能流向不同的反應方向，環(huán)境條件的差異會引發(fā)代謝朝不同的方向進行。第18頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物的生長與產(chǎn)物合成有密切相關性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。特別是對于次級代謝產(chǎn)物的合成更具有復雜性因此對發(fā)酵過程的了解不能機械的，割裂的去認識，而要從細胞代謝水平和反應工程水平全面的認識第19頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵過程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復雜性。為了全面的認識發(fā)酵過程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過程的基本方面，在此基礎上再舉一些例子，說明如何綜合分析發(fā)酵過程及進行優(yōu)化放大。第20頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月三發(fā)酵過程研究的方法和層次1、研究方法單因子實驗：對實驗中要考察的因子逐個進行試驗，尋找每個因子的最佳條件。一般用搖瓶做實驗優(yōu)點一次可以進行多種條件的實驗，可以在較快時間內(nèi)得到的結果。缺點如果考察的條件多，實驗時間會比較長各因子之間可能會產(chǎn)生交互作用，影響的結果準確性第21頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月數(shù)理統(tǒng)計學方法：運用統(tǒng)計學方法設計實驗和分析實驗結果，得到最佳的實驗條件。如正交設計、均勻設計、響應面設計。優(yōu)點同時進行多因子試驗。用少量的實驗，經(jīng)過數(shù)理分析得到單因子實驗同樣的結果，甚至更準確，大大提高了實驗效率。但對于生物學實驗要求準確性高，因為實驗的最佳條件是經(jīng)過統(tǒng)計學方法算出來的，如果實驗中存在較大的誤差就會得出錯誤的結果。第22頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月2、研究的層次初級層次的研究：一般在搖瓶規(guī)模進行試驗。主要考察目的菌株生長和代謝的一般條件，如培養(yǎng)基的組成、最適溫度、最適pH等要求。搖瓶研究的優(yōu)點是工作量大，可以一次試驗幾十種甚至幾百種條件，對于菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化有較高的效率。第23頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月代謝及工程參數(shù)層次研究：一般在小型反應器規(guī)模進行試驗。在搖瓶試驗的基礎上，考察溶氧、攪拌等搖瓶上無法考察的參數(shù)，以及在反應器中微生物對各種營養(yǎng)成分的利用速率、生長速率、產(chǎn)物合成速率及其它一些發(fā)酵過程參數(shù)的變化，找出過程控制的最佳條件和方式。由于罐發(fā)酵中全程參數(shù)的監(jiān)控是連續(xù)的，所以得到的代謝情況比較可信。第24頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月鳥苷發(fā)酵過程曲線第26頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月生產(chǎn)規(guī)模放大：在大型發(fā)酵罐規(guī)模進行試驗。將小型發(fā)酵罐的優(yōu)化條件在大型反應器上得以實現(xiàn),達到產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。一般來說微生物在不同體積的反應器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時間和分布不同，剪切力不同，滅菌時營養(yǎng)成分破壞程度不同所致。第27頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)發(fā)酵過程的中間分析發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因為微生物個體極微小，肉眼無法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因為它們反映發(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等第28頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、基質(zhì)消耗速率、關鍵酶活力等第29頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月從檢測手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa(氧傳遞系數(shù))等第30頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月直接參數(shù)又可分為在線檢測參數(shù)和離線檢測參數(shù)在線檢測參數(shù)指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉速；離線檢測參數(shù)指取出樣后測定得到的參數(shù)，如殘?zhí)?、NH2-N、菌體濃度。第31頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月一發(fā)酵過程主要分析的項目目前發(fā)酵過程主要分析項目如下1、pHpH與微生物的生命活動密切相關——酶催化活性

pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況第32頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵排氣氧的濃度表征了進氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長的活性，通過計算可以求得攝氧率（OUR）。OUR=Qo2XQo2為呼吸強度，X為菌濃度排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況，因為微生物攝入的氧并不是全部變成二氧化碳的，有的進入代謝中間物分子，進入細胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機物降解后會產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。第33頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長階段的不同而不同。測定RQ值一方面可以了解微生物代謝的狀況，另一方面也可以指導補料CER表示單位體積發(fā)酵液單位時間內(nèi)釋放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵反映了氧的利用狀況第34頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月

一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。對于這種工藝，后期的補料控制是關鍵。過程中發(fā)現(xiàn)，在補糖開始時，不但CER、OUR大幅度提高，連RQ也提高約10％，表明通過補糖不但提供了更多的碳源，而且隨著體系內(nèi)葡萄糖濃度提高，糖代謝相關酶活力也提高，產(chǎn)能增加。第35頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月3、糖含量微生物生長和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關系。糖的消耗反映產(chǎn)生菌的生長繁殖情況反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每?。通過糖含量的測定，可以控制菌體生長速率，可控制補糖來調(diào)節(jié)pH，促進產(chǎn)物合成，不致于盲目補糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測定包括總糖和還原糖。

總糖指發(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。

還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。第36頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機氮中的氮（NH2-N），單位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機氮。氨氮指無機氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌體生長情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時采取補氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時就要放罐，否則影響提取過程。第37頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月5、磷含量微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進糖代謝。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補磷措施。第38頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月6、菌濃度和菌形態(tài)菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長的情況。菌形態(tài)顯微鏡觀察菌濃度的測定是衡量產(chǎn)生菌在整個培養(yǎng)過程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長很快，中期菌濃基本恒定。補料會引起菌濃度的波動，這也是衡量補料量適合與否的一個參數(shù)。第39頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月菌濃測定方法測粘度壓縮體積法（離心）靜置沉降體積法光密度測定法OD600~660

適合于細菌、酵母第42頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月7、產(chǎn)物濃度

在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測定來了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。而且通過計算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補料、pH對產(chǎn)物形成的影響。第43頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月二產(chǎn)物量的測定（一）產(chǎn)物量的特殊表示法1、抗生素效價的表示抗生素效價表示抗生素的有效成分的多少，效價大小用單位（U）來表示效價表示方法：重量折算法重量單位類似重量單位特殊單位第44頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月重量折算單位：以最低抑菌濃度為一個單位，如青霉素0.6微克＝1U重量單位：規(guī)定某些抗生素活性部分1μg=1u如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分1μg＝1u第45頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月類似重量單位：規(guī)定抗生素的某種鹽1mg=1000u如金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定義為1μg＝1u特殊單位：藥檢所制定某些抗生素的單位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第46頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月2、酶活力的表示法酶活力用單位來表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來表示酶的量。同一種酶用不同的方法測定會有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉化一微克分子底物的酶定量為一個活性單位。第47頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）產(chǎn)物量的測定1、化學法（1）滴定法產(chǎn)物能使一定指示劑變色來指示反應終點的可用滴定法如青霉素在堿性條件下加入過量的I2，反應生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可計算出青霉素的單位檸檬酸可以用NaOH滴定來計算檸檬酸產(chǎn)量第48頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）比色法產(chǎn)物經(jīng)一定化學反應產(chǎn)生顏色，且顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，可以用比色法測定。淀粉酶活力測定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所釋放出的麥芽糖與生色試劑（3，5-二硝基水楊酸與酒石酸鉀鈉的堿溶液）產(chǎn)生顏色，它在540nm處所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第49頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）測壓法產(chǎn)物特定反應放出或攝入氣體，使系統(tǒng)有壓力變化，可以通過測定壓力變化得知產(chǎn)物量。2、物理法許多酶、抗生素都有不對稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過測定旋光度來測定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第50頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月化學和物理方法優(yōu)點：快速、方便，經(jīng)常用于過程分析缺點產(chǎn)品中存在的雜質(zhì)會干擾測定結果，因此抗生素成品的測定用生物法測定。

適用于抗生素效價的測定

生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價的標準，其原理恰好與臨床應用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。但此法得到結果比較慢，需經(jīng)過16~18小時培養(yǎng)。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價的測定。3、生物法第51頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的生物法測定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被測抗生素的不銹鋼小管，小管內(nèi)徑為6mm，高10mm的圓筒形管子，管子的重量盡可能相等。碟是攤布培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。操作方法是：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每碟15ml（下層），待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到500C左右混入試驗菌，將混有菌的培養(yǎng)基5ml加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。

第52頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月在培養(yǎng)基表面垂直放上小杯，在杯中加入待檢樣品，加滿后在370C培養(yǎng)16~18小時。在培養(yǎng)中,一方面試驗菌開始生長另一方面抗生素呈球面擴散，離杯越近，抗生素濃度越大，離杯越遠抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就叫“抑菌圈”。抗生素濃度越高，抑菌圈越大，第53頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月r:抑菌圈的半徑(毫米）M：抗生素在管中的量（單位）C：最低抑菌濃度（單位/毫升）H：培養(yǎng)基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的擴散系數(shù)（毫米/小時）T：細菌生長到肉眼所用的時間（小時）第54頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月抗生素濃度與抑菌圈的半徑成一定數(shù)學關系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的總量的對數(shù)值與抑菌圈半徑的平方呈正比。此外還受C、H、D、T的影響但是C、H、D、T是無法測量的，在實際計算中要設法消去第55頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月一般的消去方法有二劑量法標準曲線法第56頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月兩劑量法：標準品低單位總量:m抑菌圈半徑SL標準品高單位總量:M抑菌圈半徑：SH樣品高單位總量:M’抑菌圈半徑UH樣品低單位總量:m’抑菌圈半徑：UL已知：令：得出：→→第57頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月logM’—logM＝_logM’/M=同理logm’—logm=logm’/m==logθ=logθ2logθ=第58頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月logM’—logm’=logM’/m’==logKlogM—logm=logM/m==logK2logK=第59頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月標準曲線法優(yōu)點：在一個碟子上可以同時做兩個樣品的效價，當要做的樣品量大時，采取標準曲線法可以提高效率。假設選用的濃度為：3U，4U，5U，6U,7U中心點是5U1122第60頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月每個濃度做三個碟子。5U為中心點，每個碟子中有3個杯中加中心點濃度，其余3個加其它濃度。測得抑菌圈后，將濃度和抑菌圈平均直徑做標準曲線。第61頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月logMr第62頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月管碟法影響因素的討論：斜率小D、T大,誤差小截距小C、D、T、H小，誤差小第63頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月logMrlogM1r1r1r1第64頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基厚度H越小，其它條件相同時r越大。影響H的因素：培養(yǎng)基的厚度細菌生長到肉眼所需的時間T越大在其它條件相同時，r越大影響T的因素：菌體本身，及影響菌體生長的條件如：接種量，培養(yǎng)溫度、及營養(yǎng)環(huán)境其它影響因素：上層鋪得平整、菌液加入時的溫度、鋼圈的放置、滴液第65頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月在線檢測必須用專門的傳感器（也叫電極或探頭）放入發(fā)酵系統(tǒng)，將發(fā)酵的一些信息傳遞出來，為發(fā)酵控制提供依據(jù)。一參數(shù)在線檢測由于微生物培養(yǎng)過程是純培養(yǎng)過程，無菌要求高，因此對傳感器有特殊要求：插入罐內(nèi)的傳感器必須能經(jīng)受高壓蒸汽滅菌（材料、數(shù)據(jù)）傳感器結構不能存在滅菌不透的死角，以防染菌（密封性好）傳感器對測量參數(shù)要敏感，且能轉換成電信號。（響應快、靈敏）傳感器性能要穩(wěn)定，受氣泡影響小。第66頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月氨是酶反應中最常見的產(chǎn)物和反應物，氨離子可用氨氣敏電極來測定。CO2電極（測溶液中的CO2）結構與氨電極類似。測量CO2時，氣體透過電極膜，CO2和水反應，達到以下平衡：pH電極溶氧電極它們是基礎電極，以它們?yōu)榛A可以制作各種離子電極和酶電極CO2+H2OHCO3-+H+第67頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月什么因素導致pH下降？1、有機酸的積累有機酸積累pH下降補加氨水在正常代謝情況下，細胞通過EMP途徑和TCA循環(huán)的過程是為細胞合成提供前體和能量的，按照細胞經(jīng)濟學的原則不會供過于求，即不會出現(xiàn)有機酸的積累若發(fā)酵后期有機酸積累會引起加入的[NH4+]積累，相應出現(xiàn)產(chǎn)苷速率下降?！x不正常第68頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月測定以下中間物發(fā)酵后期丙酮酸積累第69頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月2、氨基酸的積累在有機酸分析的基礎上進一步通過HPLC測定發(fā)酵過程中不同時間發(fā)酵液中氨基酸，結果發(fā)現(xiàn)總氨基酸積累并且其積累晚于有機酸和[NH4+]積累。第70頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸成分分析表明，初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高，其它氨基酸濃度都較低，隨著發(fā)酵過程的進行谷氨酸很快被用于菌體合成，在8小時之前已經(jīng)降到很低水平，并始終維持在低水平，而在48小時左右丙氨酸開始出現(xiàn)明顯的積累，發(fā)酵液中積累量達到初始量的12.6倍之多，其它十余種氨基酸濃度則變化不大，并且在整個發(fā)酵過程中都維持在較低水平。因此，丙氨酸濃度變化可能是導致代謝流遷移所致。第71頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月3、分析原因發(fā)酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉化而來，因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累，丙酮酸隨后轉化為丙氨酸丙氨酸本身又會對谷氨酸合成酶（GS）造成反饋抑制和阻遏，使產(chǎn)苷速率降低。第72頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月丙酮酸積累氨水補加增加[NH4+]積累抑制GS抑制TCA循環(huán)丙酮酸積累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加惡性循環(huán)丙氨酸積累第73頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）代謝流遷移的酶學證明糖代謝途徑關鍵酶糖酵解途徑（EMP）在糖酵解途徑中有兩個不可逆的步驟的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時序分析第74頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月12小時時由于生長處于對數(shù)生長初期，代謝活力較低，所以PFK的活力相對較低。24小時后隨著發(fā)酵過程進入平穩(wěn)產(chǎn)物形成期和細胞生長期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平穩(wěn)。但是到40小時以后，鳥苷形成速率減慢甚至停止，同時觀察到氨基酸和有機酸積累，PFK相對酶活增加，這表明此時通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加。第75頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月丙酮酸激酶時序分析第76頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月丙酮酸激酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活增加，而是在24小時就基本上達到其最大值，隨后維持在恒定的水平，這表明在糖代謝時EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代謝流遷移的主要因素磷酸戊糖途徑（HMP）關鍵酶磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6－磷酸葡萄糖脫氫生成6－磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。第77頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月6－磷酸葡萄糖脫氫酶時序分析由圖可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高，這可能是前期菌體合成代謝比較活躍，通過HMP途徑合成用于細胞成分的核酸等組成物質(zhì)；隨后基本不變，從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡，此時穩(wěn)定持續(xù)的形成產(chǎn)物；但是到40小時后，6－磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，并且隨著后期發(fā)酵過程的進行而持續(xù)下降。根據(jù)物料平衡原則，有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加。第78頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月三羧酸(TCA)循環(huán)的關鍵酶三羧酸循環(huán)是“消耗”丙酮酸的途徑，三羧酸流量大丙酮酸不會積累。三羧酸循環(huán)中的關鍵酶為檸檬酸合成酶，其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，是三羧酸循環(huán)的啟動步驟，也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點，由檸檬酸合成酶所催化的反應是三羧酸循環(huán)中的第一個限速步驟。第79頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月檸檬酸合成酶時序分析第80頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月從圖可以看到，TCA循環(huán)的關鍵酶檸檬酸合成酶在整個發(fā)酵過程中，尤其是在后期產(chǎn)苷速率下降的過程中都維持比較平穩(wěn)的水平，這表明在發(fā)酵過程后期所發(fā)生的代謝流遷移時，TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加。即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間，主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的。EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現(xiàn)象。第81頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月丙氨酸脫氫酶的時序分析第82頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月在發(fā)酵中后期，丙氨酸脫氫酶活力出現(xiàn)了明顯的增加。丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時序增加相吻合，這些數(shù)據(jù)表明代謝流的溢流現(xiàn)象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點，通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸，從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡。結果加入EMP途徑的抑制劑，克服了代謝流遷移的問題，提高了鳥苷的產(chǎn)量第83頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）與產(chǎn)物合成相關的酶和中間物測定例：螺旋霉素生物合成的代謝研究第84頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月圖3螺旋霉素生物合成代謝網(wǎng)絡途徑

第85頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月圖1螺旋霉素生物合成中間物動態(tài)流量分布圖

哪個代謝中間物過多積累第86頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月在發(fā)酵后期有FO-Ⅱ積累，要減少FO-Ⅰ轉化為FO-Ⅱ必須降低C3?；傅幕盍?，但這與SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾在發(fā)酵結束時，SP-Ⅰ還有一定的積累，如能最大限度的轉化為SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加強步驟3對發(fā)酵效率和發(fā)酵效價是有積極意義的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最終積累則導致流量浪費，因為這兩種物質(zhì)最終不能轉化為目的產(chǎn)物。因此必須減小步驟4的通量。但由于這幾個步驟的轉化都是由C3?；复呋磻@給改變通量帶來一定的困難。第87頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月圖2有機酸前體的動態(tài)流量分布圖第88頁，課件共99頁，創(chuàng)作于2023年2月在圖2中，乙酸和丁酸在從40小時開始積累并在64小時達到最高值，對照圖3螺旋霉素生物合成代謝網(wǎng)絡途徑[9]，我們可以推測在發(fā)酵中前期在圖3中的步驟1也即大環(huán)成環(huán)步驟有一定程度的“瓶頸”影響，從而導致乙酸、丁酸有一定的積累。若能加強這一步驟的通量，應能提高代謝網(wǎng)絡的通量，提高螺旋霉素的效價。我們測定了內(nèi)酯環(huán)合成相關的酶活——前體的活化第89頁，課件共99頁，創(chuàng)作于202