抗體檢測技術與類風濕因子

抗體檢測技術與類風濕因子抗體檢測技術與類風濕因子第1頁抗體檢測技術免疫酶技術免疫熒光技術凝集反應沉淀反應補體結合試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

抗體檢測技術與類風濕因子第2頁凝集反應

凝集反應是指顆粒抗原與對應抗體結合反應出現可見性現象。顆?？乖缤暾毦?、紅細胞等與對應抗體相混合，在一定條件下出現凝集。凝集反應中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。抗體檢測技術與類風濕因子第3頁沉淀反應1、絮狀沉淀反應2、環(huán)狀沉淀反應3、雙向擴散4、單向免疫擴散抗體檢測技術與類風濕因子第4頁雙向擴散法操作：生理鹽水配制1%-5%瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原存在和定性抗原。抗體檢測技術與類風濕因子第5頁抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不一樣，沉淀弧特征不一樣：抗原抗體為多體系時，出現沉淀弧有多條，彼此互不干擾。抗體檢測技術與類風濕因子第6頁

酶聯(lián)免疫吸附測定試驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

抗體檢測技術與類風濕因子第7頁試驗原理ELISA利用了免疫反應高度特異性和酶促反應高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶活性按一定步驟進行抗原抗體反應加底物顯色，依據顏色反應深淺進行定性或定量分析抗體檢測技術與類風濕因子第8頁方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，依據試劑起源、標本性狀以及檢測詳細條件，可設計出不一樣類型檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法抗體檢測技術與類風濕因子第9頁抗體檢測技術與類風濕因子第10頁抗體檢測技術與類風濕因子第11頁抗體檢測技術與類風濕因子第12頁AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.抗體檢測技術與類風濕因子第13頁一、試劑及儀器準備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強②能保持Ag或Ab活性③不參加化學反應

抗體檢測技術與類風濕因子第14頁⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結果差異大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標抗IgG，顯色后，測20孔OD，要求CV<10%⑶常見載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應板抗體檢測技術與類風濕因子第15頁2.Ag或Ab：純度高、效價高、結協(xié)力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化過程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附干擾抗體檢測技術與類風濕因子第16頁㈡酶結合物：1.要求：純度高、催化轉化率高、專一性強、性質穩(wěn)定、起源豐富、標識后穩(wěn)定2.常見酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光抗體檢測技術與類風濕因子第17頁4.酶結合物制備：戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法抗體檢測技術與類風濕因子第18頁（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式不一樣，各有特制適合用于板、珠和小試管設計性能指標：測讀速度、讀數準確性、重復性、準確度和可測范圍、線性優(yōu)良酶標儀讀數普通可準確0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30min，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選取產物敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有酶標儀可用雙波長式測讀抗體檢測技術與類風濕因子第19頁抗體檢測技術與類風濕因子第20頁用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces抗體檢測技術與類風濕因子第21頁WESTERNBLOT步驟：試劑準備：1、SDS試劑:見電泳試驗。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

抗體檢測技術與類風濕因子第22頁樣品制備含量測定抗體檢測技術與類風濕因子第23頁SDS－PAGE電泳抗體檢測技術與類風濕因子第24頁轉膜抗體檢測技術與類風濕因子第25頁免疫反應抗體檢測技術與類風濕因子第26頁化學發(fā)光抗體檢測技術與類風濕因子第27頁類風濕因子類風濕因子（rheumatoidfactor,RF）可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在臨床內科學中描述為四型，沒有IgD型；但在試驗室診療學中描述為5型），是類風濕關節(jié)炎血清中針對IgGFC片段上抗原表位一類本身抗體，類風濕因子陽性患者較多伴相關節(jié)外表現，如皮下結節(jié)及血管炎等?？贵w檢測技術與類風濕因子第28頁類風濕因子約90%類風濕性關節(jié)炎（RA）患者RF呈陽性。IgA-RF與骨質破壞相關，早期IgA-RF升高常提醒病情嚴重，預后不良；IgE-RF升高時，已屬病情晚期。一些本身免疫病，如冷球蛋白血癥、進行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等患者都有較高陽性率；一些其它疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現RF。抗體檢測技術與類風濕因子第29頁類風濕因子多年來對IgM型類風濕因子生物作用已經有所了解，這些生物作用包含：1、調整體內免疫反應；2、激活補體，加緊去除微生物感染