遺傳的制作和基因定位專家講座

4.5細菌遺傳分析與基因定位4.5.1細菌轉(zhuǎn)化和基因定位轉(zhuǎn)化：指一些細菌能經(jīng)過其細胞膜攝取周圍供體染色體片段，將另外源DNA片段經(jīng)過重組加入自己染色體組過程。1928年，格里費斯(GriffithF.)在肺炎雙球菌中發(fā)覺轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。1944年，阿委瑞(AveryO.T.)成功地進行了肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗；證實遺傳物質(zhì)是DNA；轉(zhuǎn)化是細菌交換基因方法之一。遺傳的制作和基因定位專家講座第1頁

細菌中大部分轉(zhuǎn)化工作是用下面三種細菌完成：肺炎雙球菌，枯草桿菌和流感嗜血桿菌。轉(zhuǎn)化主要分為二個步驟進行:(一)供體DNA與受體細胞間接觸與互作肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化：DNA片斷最少有800個堿基對；枯草桿菌轉(zhuǎn)化：DNA片斷最少有16000個堿基對。轉(zhuǎn)化第一步是使轉(zhuǎn)化DNA與受體細菌間成功地相互作用，這包含：轉(zhuǎn)化片段大小、形態(tài)、濃度和受體細胞生理狀態(tài)。

①.轉(zhuǎn)化片斷大小：遺傳的制作和基因定位專家講座第2頁②.供體DNA分子存在數(shù)目：對特定基因來說，供體DNA分子數(shù)目與成功轉(zhuǎn)化相關。鏈霉素抗性基因轉(zhuǎn)化：在每個細胞含有10個DNA分子之前，抗性轉(zhuǎn)化體數(shù)目一直與DNA分子存在數(shù)目成正比。原因：在細菌細胞壁或細胞膜上有固定數(shù)量DNA接收座位，故普通細菌攝取DNA分子數(shù)小于10個。③．受體生理狀態(tài)：受體細胞必須在生理上處于感受態(tài)。這種感受態(tài)只能發(fā)生在細菌生長周期某一時間范圍內(nèi)，在感受態(tài)內(nèi)，活躍合成蛋白質(zhì)細菌細胞壁多少發(fā)生改變而易于接收轉(zhuǎn)化DNA。遺傳的制作和基因定位專家講座第3頁㈡、轉(zhuǎn)化DNA攝取和整合過程：細菌中轉(zhuǎn)化，包含供體DNA結(jié)合與穿入，聯(lián)會和整合。當細菌處于感受態(tài)時，外源雙鏈DNA分子可結(jié)合在受體細胞表面接收座位上。細菌在攝取外源DNA時，由DNA移位酶降解其中一條鏈，并利用降解這條鏈產(chǎn)生能量，將另一條鏈拉進細胞中。

①.結(jié)合與穿入：供體單鏈DNA片段一旦進入細胞，按各個不一樣位點與其對應受體DNA片段聯(lián)會。

②.聯(lián)會：單鏈轉(zhuǎn)化DNA經(jīng)過與受體DNA對應位點置換從而穩(wěn)定地參入到受體DNA中。③．整合(重組)：遺傳的制作和基因定位專家講座第4頁遺傳的制作和基因定位專家講座第5頁(三)轉(zhuǎn)化和基因重組作圖比如：黎德伯格等用枯草桿菌進行轉(zhuǎn)化和重組試驗DNA片段進入受體細胞之后，可與受體染色體發(fā)生重組。緊密連鎖兩個基因有較多機會包含在同一個DNA片段中，并同時整合到受體染色體中。遺傳的制作和基因定位專家講座第6頁遺傳的制作和基因定位專家講座第7頁Trp2his2tyr1<-----------34-----------><----13-------><--------------------40--------------------->三者并發(fā)轉(zhuǎn)化頻率最高，故這3個基因是連鎖，其中his2和tyr1連鎖緊密：單交換時，染色體開環(huán)易降解，故不存在單交換類型；只有雙交換和偶數(shù)多交換才有效。遺傳的制作和基因定位專家講座第8頁4.5.2細菌接合和基因定位1.接合：是指原核生物遺傳物質(zhì)從供體(donor)轉(zhuǎn)移到受體(receptor)內(nèi)過程。特點：需經(jīng)過細胞直接接觸。遺傳的制作和基因定位專家講座第9頁B菌株：Met+bio+thr-leu-，需加蘇氨酸和亮氨酸。不一樣營養(yǎng)缺點型大腸桿菌：A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。4.5.2.1黎德伯格和塔特姆（1946年）：A菌株和B菌株營養(yǎng)缺點型，不能在基本培養(yǎng)上生長。A+B菌株混合培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基上，幾小時后離心，涂布基本培養(yǎng),長出原養(yǎng)型(Met+bio+thr+leu+)菌落。遺傳的制作和基因定位專家講座第10頁這種原養(yǎng)型細胞怎樣出現(xiàn)？轉(zhuǎn)化？細胞間直接接觸而發(fā)生遺傳物質(zhì)交換和重組?A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上

一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合

結(jié)果任何一臂培養(yǎng)基上均未長出原養(yǎng)型細菌?！嘀苯咏佑|(接合)是原養(yǎng)型細胞出現(xiàn)必要條件。大分子可經(jīng)過，細菌不能經(jīng)過Hayes(1952)試驗證實：接合過程是一個單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)

B菌株，從供體“donor”到受體“receptor”。遺傳的制作和基因定位專家講座第11頁⑴．F因子：致育因子(性因子)，是一個附加體。攜帶F因子菌株稱為供體菌或雄性，用F＋表示。未攜帶F因子菌株為受體菌或雌性，用F－表示。5.4.2.2細菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移是單向⑵．F因子組成：染色體外遺傳物質(zhì)，環(huán)狀DNA；

40-60個蛋白質(zhì)基因；2-4個/細胞(雄性內(nèi))。

遺傳的制作和基因定位專家講座第12頁4.5.2.3F因子三種狀態(tài)：以大腸桿菌為例：②．一個自主狀態(tài)F因子，即F＋；

③．帶有一個整合F因子細胞叫高頻重組細胞，Hfr細胞。①．沒有F因子，即F－；遺傳的制作和基因定位專家講座第13頁⑷．自主狀態(tài)時F因子獨立進行分裂。F＋×F－：先形成接合管，F(xiàn)因子DNA邊轉(zhuǎn)移邊復制，F(xiàn)－細胞

F＋細胞。遺傳的制作和基因定位專家講座第14頁F因子整合到細菌染色體上(F＋

Hfr細胞)，其繁殖與細菌染色體同時進行。此時，細菌基因重組頻率增加4倍以上，所以染色體上整合有F因子菌株，稱為Hfr菌株。㈡、Hfr細胞形成及染色體轉(zhuǎn)移：遺傳的制作和基因定位專家講座第15頁細菌染色體由一小段單鏈F因子為前導而轉(zhuǎn)移到F-受體

邊進入邊合成。普通情況下僅小部分細菌染色體能夠轉(zhuǎn)入，接合中止

受體細胞仍為F－，F(xiàn)因子仍留在供體內(nèi)。遺傳的制作和基因定位專家講座第16頁部分二倍體中發(fā)生交換:單數(shù)交換：打開環(huán)狀染色體，產(chǎn)生一個線性染色體，這種細胞是不能成活。偶數(shù)交換：產(chǎn)生可遺傳重組體和片段。部分二倍體：當F＋或Hfr細菌染色體進入F－后，在一個短時期內(nèi)，F(xiàn)－細胞內(nèi)一些位點就會成為二倍體DNA。遺傳的制作和基因定位專家講座第17頁4.5.2.5中止雜交作圖中止雜交：就是將兩個菌株（比如Hfra+strs×F-a-

strr）在培養(yǎng)液中進行通風培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中止雜交，經(jīng)過稀釋接種到判別培養(yǎng)基上，待形成菌落后判定它們基因型。

遺傳的制作和基因定位專家講座第18頁1955年Wollman和Jacob首次進行中止雜交試驗：供體菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受體菌：F-

strrthr?leu-azirtonrlac-gal-將大約10倍F-菌與Hfr對數(shù)期菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)在不一樣時間間隔取樣，然后在組織攪拌中猛烈振蕩,中止雜交振蕩后培養(yǎng)物涂布于加了鏈霉素基本培養(yǎng)基上篩選不一樣于兩個親本thr+leu+strr重組子再對每一個重組子非選擇性標識azitonlacgal

進行測定。

azi：疊氮化鈉抗性，ton：噬菌體T1抗性中止雜交試驗過程遺傳的制作和基因定位專家講座第19頁遺傳的制作和基因定位專家講座第20頁中止雜交試驗結(jié)果遺傳的制作和基因定位專家講座第21頁遺傳的制作和基因定位專家講座第22頁（1）不一樣非選擇標識進入受體且重組時間不一樣，但都是穩(wěn)定；（2）各基因重組頻率伴隨時間增加而增加，直至極值；（3）按時間次序，先重組和后重組基因，重組率極值在逐步降低；遺傳的制作和基因定位專家講座第23頁該方法主要依據(jù)基因轉(zhuǎn)移先后次序，以時間為單位，求基因間遺傳距離。利用中止雜交試驗作圖遺傳的制作和基因定位專家講座第24頁

大腸桿菌染色體是環(huán)形不一樣Hfr菌株進行中止雜交試驗，基因轉(zhuǎn)移次序、起點和轉(zhuǎn)移方向各不相同。推斷大腸桿菌染色體為環(huán)形，而F因子在細菌染色體上有許多插入位點，且插入方向不一樣。HfrH othrazilactsxgaltrpmalxylmetBthiFCotsxlacazithrthimetBxylmaltrpgalFJ4othimetBxylmaltrpgaltsxlacazithrFP72ometBthithrazilactsxgaltrpmalxylFTrpmalGalxyltsxmetBlacthi

azithrCP72HJ4遺傳的制作和基因定位專家講座第25頁細菌染色體為環(huán)狀遺傳的制作和基因定位專家講座第26頁當轉(zhuǎn)移時間間隔在兩分鐘之內(nèi)，如已知lac與ade緊密連鎖，距離約為1分鐘，中止雜交作圖就不可靠，須用傳統(tǒng)重組作圖(recombinationmapping)。

紫紅色菌落：lac+ade+780（親本型）白色或粉紅色菌落：lac-

ade+220（重組型）Hfr:lac+ade+strsXF-:lac-ade-strr

混合60min

F-：ade+strr

1000

MM+str影印EMB五、重組作圖二個基因緊密連鎖:lac-：乳糖不發(fā)酵ade-：腺嘌呤缺點型遺傳的制作和基因定位專家講座第27頁1、重組子產(chǎn)生lac-ade+strrlac+ade+strrlac+ade+strslac-ade-strrlac-ade-strslac+ade+strslac-ade-strrlac+ade-strs遺傳的制作和基因定位專家講座第28頁

2、重組頻率計算1分鐘相當于20%重組值，即：1min=20cMRFlac-ade=*100%lac-ade+lac+ade++lac-ade+

=*100%=22%=22cM2201000遺傳的制作和基因定位專家講座第29頁3、大腸桿菌遺傳圖譜圖距單位：分鐘總長度：100分鐘起點（0分鐘）：thr座位大腸桿菌環(huán)形遺傳學圖遺傳的制作和基因定位專家講座第30頁遺傳的制作和基因定位專家講座第31頁4.5.3細菌轉(zhuǎn)導和作畫1.定義：以噬菌體為媒介所進行細菌遺傳物質(zhì)重組過程，稱轉(zhuǎn)導。2.發(fā)覺●Lederbery及其碩士Zinder（1951）首先在鼠傷寒沙門氏菌（Salmenellatyphimurium）中發(fā)覺轉(zhuǎn)導現(xiàn)象。

●發(fā)覺過程他們用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸營養(yǎng)缺點型鼠傷寒沙門氏菌和甲硫氨酸、組氨酸營養(yǎng)缺點型鼠傷寒沙門氏菌共同培養(yǎng)，相當讓兩種不一樣缺點型菌雜交。雜交過程和結(jié)果以下：

遺傳的制作和基因定位專家講座第32頁

LT22phe-try-tyr-

×

LT2met-his-

（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）

（甲硫氨酸、組氨酸）營養(yǎng)缺點型↓

營養(yǎng)缺點型

原養(yǎng)型菌落（即出現(xiàn)個別正常型細菌）

那么這些原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)是由接合引發(fā)？還是由轉(zhuǎn)化引發(fā)？他們先進行U形管試驗（P159），結(jié)果在LT22一臂取得原養(yǎng)型菌株，由此推測可能有一個可經(jīng)過濾膜過濾性因子（FA）在起作用。深入利用DNA酶處理，結(jié)果FA不受DNA酶影響，從而消除了轉(zhuǎn)化作用可能性。最終認為FA是一個噬菌體，發(fā)覺了轉(zhuǎn)導。遺傳的制作和基因定位專家講座第33頁遺傳的制作和基因定位專家講座第34頁3.轉(zhuǎn)導機制轉(zhuǎn)導是在噬菌體包裝中因為錯誤將細菌染色體片段包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段“假噬菌體”而發(fā)生。詳細過程以下：

（1）噬菌體侵染細菌。（2）噬菌體DNA使細菌染色體形成片段，合成噬菌體DNA和外殼。（3）新噬菌體包裝，偶然將細菌染色體片段也包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段“假噬菌體”。“假噬菌體”和真噬菌體一起釋放出來。

遺傳的制作和基因定位專家講座第35頁（4）“假噬菌體”和真噬菌體一樣可再侵染細菌，其中“假噬菌體”侵染時，就將外來細菌基因注入，經(jīng)過基因重組改變遺傳性狀，完成轉(zhuǎn)導過程。當前依據(jù)轉(zhuǎn)導機制，已廣泛應用在體外包裝“假噬菌體”，即將外源基因?qū)搿凹偈删w”中，再侵染細菌，進行基因表示研究。遺傳的制作和基因定位專家講座第36頁1.普遍性轉(zhuǎn)導

普遍性轉(zhuǎn)導：指P1、P22等能夠轉(zhuǎn)導沙門氏菌染色體組任何不一樣部分。假如兩個基因一直是一起轉(zhuǎn)導或同時轉(zhuǎn)導（共轉(zhuǎn)導或并發(fā)轉(zhuǎn)導）頻率較高，那么證實兩基因連鎖，而且頻率越高，則兩基因距離越近。如：a基因和b基因共轉(zhuǎn)導頻率高，a和c共轉(zhuǎn)導頻率也高，b和c共轉(zhuǎn)導頻率低，則3個基因次序為bac遺傳的制作和基因定位專家講座第37頁遺傳的制作和基因定位專家講座第38頁若同時觀察3因子轉(zhuǎn)導分析，則只做一次試驗就可推出其次序。舉例：利用普遍性轉(zhuǎn)導測知leu，thr，azi三個基因次序。方法：（1）用噬菌體P1侵染帶leu+，thr+和azi+大腸桿菌。（2）用從該大腸桿菌釋放出來噬菌體，再侵染leu-、thr-和azi-大腸桿菌。遺傳的制作和基因定位專家講座第39頁

(3)把受體菌接種到不含thr選擇培養(yǎng)基上對thr+進行選擇，凡具thr+細菌都可生長，把此菌接種到其它培養(yǎng)基上，結(jié)果在選出thr+重組子只有3%leu+，但無一個同時也是azi+。若選擇leu+重組子，則約有50%同時也是azi+，所以3基因次序應為thr+leu+azi+。P165遺傳的制作和基因定位專家講座第40頁遺傳的制作和基因定位專家講座第41頁遺傳的制作和基因定位專家講座第42頁遺傳的制作和基因定位專家講座第43頁遺傳的制作和基因定位專家講座第44頁2.特異性（不足）轉(zhuǎn)導１概念：只能轉(zhuǎn)移細菌染色體特定部分基因轉(zhuǎn)導.2不足轉(zhuǎn)導過程3轉(zhuǎn)導機制:是因為噬菌體在細菌染色體特定位點上整合。4低頻轉(zhuǎn)導與高頻轉(zhuǎn)導

噬菌體

↓感染供體菌→裂解液(轉(zhuǎn)導噬菌體)→非溶源

(溶源菌)

(10-6)

性細菌溶源性轉(zhuǎn)導子重組性轉(zhuǎn)導子低頻轉(zhuǎn)導：指溶源性細菌經(jīng)誘導所釋放噬菌體所

進行轉(zhuǎn)導.遺傳的制作和基因定位