外源基因的原核表達(dá)

外源基因的原核表達(dá)第1頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20231外源基因表達(dá)的作用：外源基因表達(dá)泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。外源基因的表達(dá)是研究和探索基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的重要方法，也是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、診斷試劑必不可少的手段。通過(guò)外源基因的表達(dá)可由宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量的目的蛋白。第2頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20232常用的原核外源表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)第3頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20233原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：1、原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。2、基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。3、多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。第4頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20234原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：4、不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)象。5、內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。由于以上特點(diǎn)，近年來(lái)真核生物表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展很快，并構(gòu)建了相應(yīng)的基因表達(dá)載體。第5頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20235大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。屬革蘭氏陰性細(xì)菌。其特點(diǎn)是：遺傳背景清楚目的基因表達(dá)水平高培養(yǎng)時(shí)間短第6頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20236大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要不足1、缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工過(guò)程。2、表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性3、宿主本身雜蛋白質(zhì)多，純化步驟復(fù)雜。第7頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20237大腸桿菌基因表達(dá)載體理想的大腸桿菌表達(dá)載體的特征1、穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力，在無(wú)選擇壓力下保存于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記3、轉(zhuǎn)錄可以調(diào)控，抑制時(shí)本底轉(zhuǎn)錄水平較低4、轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止且轉(zhuǎn)錄不影響載體的復(fù)制5、具備適用于外源基因插入酶切位點(diǎn)第8頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20238大腸桿菌基因表達(dá)載體構(gòu)成1、復(fù)制子：是一段包含起始位點(diǎn)和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。其功能是通過(guò)復(fù)制使載體穩(wěn)定存在于大腸桿菌細(xì)胞。第9頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20239大腸桿菌基因表達(dá)載體2、篩選標(biāo)記：大腸桿菌經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后，僅有少數(shù)細(xì)菌能獲得攜帶外源基因的質(zhì)粒并穩(wěn)定地傳代，篩選標(biāo)記可有效地篩選出轉(zhuǎn)化有外源基因的陽(yáng)性重組。第10頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202310大腸桿菌基因表達(dá)載體3、啟動(dòng)子：是與DNA依賴的RNA聚合酶相結(jié)合的一段DNA序列。啟動(dòng)子是調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件，與mRNA的合成有很大關(guān)系，是表達(dá)載體不可缺少的元件。第11頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202311大腸桿菌基因表達(dá)載體4、終止子：在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中能在特異位點(diǎn)將轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列。有兩種類型1、ρ－因子型終止子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)第12頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202312第13頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202313大腸桿菌基因表達(dá)載體4、終止子：能在特異位點(diǎn)終止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。終止子有兩種類型1、ρ－因子2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)第14頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202314第15頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202315第16頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202316終止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的長(zhǎng)度（2）、提高mRNA的穩(wěn)定性（3）、避免載體上其他基因的異常表達(dá)第17頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202317大腸桿菌基因表達(dá)載體5、核糖體結(jié)合位點(diǎn)：原核細(xì)胞mRNA蛋白合成起始點(diǎn)上游的一段非編碼序列。能與30S小亞基中16SrRNA3’末端的一段序列特異結(jié)合。此序列富含嘌呤，核心序列為SD序列。第18頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202318大腸桿菌基因表達(dá)載體6、密碼子：密碼子有簡(jiǎn)并性，多個(gè)密碼子為一個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼，不同生物在利用這些密碼子時(shí)其利用頻率不同，不同的密碼子會(huì)影響到大腸桿菌的翻譯速度。第19頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202319基因表達(dá)的機(jī)制基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)。迄今為止，已構(gòu)件建了不同類型的表達(dá)系統(tǒng)，可根據(jù)需要合理地選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括：1、轉(zhuǎn)錄2、翻譯兩個(gè)環(huán)節(jié)第20頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202320基因表達(dá)的機(jī)制基因工程的核心問(wèn)題：有效表達(dá)外源基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟：起始轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)的限速步驟：轉(zhuǎn)錄起始的速率構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)首先要考慮的問(wèn)題是：1、選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子2、相關(guān)的調(diào)控序列第21頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202321目的：在細(xì)胞生長(zhǎng)的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定的密度時(shí)，在某種特定的誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄合成mRNA。啟動(dòng)子原核生物啟動(dòng)子真核生物啟動(dòng)子誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型組成型組成型第22頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202322mRNA的延伸與穩(wěn)定性：有效表達(dá)的關(guān)鍵是：保持mRNA的1、有效延伸2、正確終止3、mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定存在第23頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202323mRNA的有效延伸：導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的可能原因有和解決辦法1、衰減子：類似于簡(jiǎn)單的終止子，在原核生物中一般位于操縱子的啟動(dòng)子與第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)應(yīng)避免該序列的存在。第24頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023242、非特異終止：防止非特異性終止的方法是在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)加入抗終止的序列元件。第25頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202325轉(zhuǎn)錄的正確終止也是外源基因有效表達(dá)的重要因素，可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。原核生物解決辦法真核生物解決辦法第26頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202326mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定存在：mRNA在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定存在直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。解決辦法1、原核生物：選擇一個(gè)RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正確加工第27頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202327外源基因mRNA的有效翻譯為使外源基因有效翻譯，在構(gòu)建表達(dá)體系時(shí)應(yīng)考慮以下問(wèn)題：1、AUG為首選起始密碼子2、SD序列為與核糖體結(jié)合位點(diǎn)3、SD序列與起始密碼子之間的距離為3～9個(gè)堿基4、在翻譯起始區(qū)周?chē)男蛄胁灰仔纬擅黠@的二級(jí)結(jié)構(gòu)5、選擇合適的終止密碼子第28頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202328表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性常用的措施有：1、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)2、構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)3、構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)4、選擇蛋白水解酶基因缺陷受體系統(tǒng)第29頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202329外源基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞的位置：外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物可能存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞外培養(yǎng)基中。其表達(dá)形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白第30頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202330大腸桿菌載體的表達(dá)方式非融合表達(dá)載體融合表達(dá)載體帶純化標(biāo)簽表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體表面展示表達(dá)載體帶分子伴侶表達(dá)載體第31頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023311、非融合表達(dá)載體：應(yīng)用此種載體表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的細(xì)胞因子類產(chǎn)品多采用此類表達(dá)載體。2、融合表達(dá)載體：分子量較小的蛋白質(zhì)常用此類載體進(jìn)行表達(dá)。將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因閱讀框。第32頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202332在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，一般將受體菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白與菌體自身蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)后其穩(wěn)定性大大增加。其原因?yàn)椋和庠葱》肿拥鞍咨系拿盖形稽c(diǎn)暴露于分子的表面。當(dāng)以融合蛋白的形式表達(dá)后，外源蛋白部分在菌體自身蛋白的引導(dǎo)下正確折疊，可最大程度上封閉酶切位點(diǎn)。第33頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202333帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體：載體上具有一段特殊序列，該序列表達(dá)后可作為純化標(biāo)簽。目的基因與該序列融合表達(dá)后，用親和層析的方法很方便的將目的蛋白分離，切除標(biāo)簽序列后可得到純化的目的蛋白。第34頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202334分泌型表達(dá)載體：將目的基因與信號(hào)肽融合表達(dá)，表達(dá)蛋白在信號(hào)肽的引導(dǎo)下成為分泌蛋白。表面展示載體：將目的基因克隆到細(xì)菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)基因中，從而達(dá)到細(xì)菌表面表達(dá)。帶分子伴侶的表達(dá)載體：第35頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202335第36頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202336第37頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202337第38頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202338宿主菌大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的基因一般都是異源基因，甚至是真核生物基因，而在細(xì)胞內(nèi)積累大量的異源蛋白極易被降解。造成重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因有：1、大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)；第39頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023392、大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定因子；3、大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。由于以上原因，為使外源基因高效表達(dá)，必須構(gòu)建作為基因表達(dá)受體菌的工程菌株。第40頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202340常見(jiàn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)：以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)大腸桿菌tacI基因誘變，獲得能過(guò)量表達(dá)lacI

阻遏蛋白的基因突變體lacIq，使外源基因的表達(dá)調(diào)控在一定的水平。此外，目前還構(gòu)建了阻遏蛋白溫度敏感型突變體lacIq(ts)宿主菌和載體，使lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度的控制，在低溫(30oC)下基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，在(42oC)下基因的轉(zhuǎn)錄保持開(kāi)放。第41頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202341常見(jiàn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)PL和PR啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)：以λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL和PR構(gòu)建的。在野生型λ噬菌體中，PL和PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄與否決定λ噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)或溶原循環(huán)。λ噬菌體PE啟動(dòng)子控制的cl基因表達(dá)產(chǎn)物是PL和PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的阻遏物，而其表達(dá)和在細(xì)胞中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子這間的復(fù)雜平衡關(guān)系。通過(guò)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)cl在細(xì)胞中含量的途徑很難操作，因此在構(gòu)建表達(dá)體系時(shí)，選用溫度敏感突變體cl1857(ts)的基因產(chǎn)物調(diào)控PL和PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。第42頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202342常見(jiàn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)T7表達(dá)體系：利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的，具有很高表達(dá)能力的表達(dá)系統(tǒng)。T7噬菌體RNA聚合酶能選擇性地激活T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，這是一種活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相當(dāng)于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。在大腸桿菌宿主細(xì)胞中，受T7噬菌體啟動(dòng)子控制的基因在T7噬菌體RNA聚合酶存在下進(jìn)行高表達(dá)。第43頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202343常見(jiàn)的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株菌株基因型啟動(dòng)子BL21hsdSgalT7噬菌體HMS174recA1hsdRrifT7噬菌體M5279lacZtrpArpsLλ噬菌體PL

RB791W3110lacIqL8lac,tac第44頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202344大腸桿菌高效表達(dá)目的基因策略對(duì)表達(dá)相關(guān)元件進(jìn)行優(yōu)化提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性第45頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202345表達(dá)相關(guān)元件的優(yōu)化主要包括與表達(dá)相關(guān)的啟動(dòng)子序列和決定mRNA翻譯的SD序列。具體方法為組合強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)終止子；增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列；調(diào)整SD序列與起始密碼ATG之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近序列轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。第46頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202346表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì)mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：

SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3～6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6～8個(gè)堿基長(zhǎng)度，與AAGAA的最適距離是5～7個(gè)堿基長(zhǎng)度ATG與UAAGGAGG至少相隔3～4個(gè)堿基，與AAGAA至少相隔5個(gè)堿基；mRNA的翻譯才能進(jìn)行ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時(shí)，mRNA翻譯效率較高。第47頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202347

核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因mRNA5’端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究表明討mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。在必要的情況下，還可通過(guò)定點(diǎn)突變，PCR等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來(lái)破壞mRNA5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè)SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因5’端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下第48頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202348表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)

在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列

能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強(qiáng)子。

第49頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202349提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用簡(jiǎn)并密碼子的使用頻率不同與相應(yīng)tRNA在細(xì)胞中的豐度有關(guān)。過(guò)多使用低豐度tRNA時(shí)，會(huì)因tRNA耗盡而影響翻譯?？蓪⑼庠椿蛑型x密碼子進(jìn)行點(diǎn)突變，成為受體菌中常用密碼子而提高表達(dá)能力。第50頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202350共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛(ài)性高于表達(dá)水平低的基因。

現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有：編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA編碼Cys的密碼子UGU、UGC;編碼Gly的密碼子GGA、GGG編碼Leu的密碼子CUA、CUC編碼Ile的密碼子AUA編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC編碼Thr的密碼子ACA四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第51頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202351共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過(guò)程中發(fā)生中止和移碼突變。

解決這一問(wèn)題的辦法：通過(guò)基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)第52頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202352提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，其蛋白水解酶的活性可能會(huì)增加。因此必需提高外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法有：1、將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中；2、選用某些蛋白水解酶缺陷株；3、對(duì)外源蛋白中水解酶敏感的序列進(jìn)行修飾或改造；4、在表達(dá)外源蛋白的同時(shí)，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。第53頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202353提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性：大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識(shí)別外源DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行降解。為了保持外源mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可采取兩種措施：1、盡可能減少核酸外切酶對(duì)外源基因mRNA的降解；2、改變外源基因mRNA的結(jié)構(gòu)，使之不易被酶降解。第54頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202354提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性

由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對(duì)不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。第55頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202355提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)。共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。第56頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202356

但必須指出的是，由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為：大腸桿菌對(duì)分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長(zhǎng)速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低，甚至沒(méi)有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫(kù)還不完整。第57頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202357優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程：工藝的優(yōu)化生物學(xué)因素的優(yōu)化第58頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202358工藝的優(yōu)化擴(kuò)大培養(yǎng)的條件優(yōu)化反應(yīng)器的優(yōu)化第59頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202359生物學(xué)因素的優(yōu)化溶氧量pH值溫度培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的混合情況第60頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202360四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞

大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過(guò)單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來(lái)實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種

第61頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202361構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問(wèn)題。雖然在發(fā)酵過(guò)程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補(bǔ)料速度等措施來(lái)控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實(shí)際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問(wèn)題的途徑之一。第62頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202362芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌是對(duì)人畜無(wú)害的革蘭氏陽(yáng)性土壤微生物。細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白到胞外，目前已成為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種。第63頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023631、多為非致病性微生物2、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速3、表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性4、遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作5、培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)比較成熟第64頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202364芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足1、芽孢桿菌分泌的蛋白酶量大、種類多，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性形成很大威脅2、載體不穩(wěn)定，易造成外源基因的丟失第65頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202365芽孢桿菌表達(dá)載體復(fù)制子：目前廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌表達(dá)載體的復(fù)制子有：1、來(lái)源于金色葡萄球菌的復(fù)制子如pUB110、pC194和pE194等質(zhì)粒表達(dá)載體。2、來(lái)源于小芽孢桿菌的復(fù)制子如pHY481、pWT481等。第66頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202366芽孢桿菌表達(dá)載體啟動(dòng)子：在利用芽孢桿菌表達(dá)體系時(shí)，必需使用芽孢桿菌能夠識(shí)別的啟動(dòng)子。芽孢桿菌含有多種轉(zhuǎn)錄起始識(shí)別因子(σ)，在芽孢桿菌中已鑒定的σ

已達(dá)十種。啟動(dòng)子可被特異的σ

因子識(shí)別。芽孢桿菌啟動(dòng)表達(dá)具有明顯的時(shí)序性，與菌體的生長(zhǎng)周期和生理代謝活動(dòng)密切相關(guān)。第67頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202367表達(dá)載體：1、自主復(fù)制質(zhì)粒芽孢桿菌的自主復(fù)制質(zhì)粒大多為無(wú)抗性標(biāo)志的隱蔽質(zhì)粒。帶有抗性標(biāo)志的自主復(fù)制質(zhì)粒主要來(lái)自其它革蘭氏陽(yáng)性菌，如金黃色葡萄球菌如pUB110、pC194和pE194，并在這些質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙標(biāo)記質(zhì)粒等載體。自主復(fù)制質(zhì)粒不穩(wěn)定，在復(fù)制過(guò)程中易發(fā)生丟失。第68頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023682、整合質(zhì)粒：在大腸桿菌質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加一個(gè)芽孢桿菌的抗性標(biāo)志，以及待整合的目的基因。因其沒(méi)有芽孢桿菌的復(fù)制子，不能自主復(fù)制，整合到芽孢桿菌染色體后，隨細(xì)胞復(fù)制而復(fù)制。3、噬菌體：Φ105、SPβ及其它噬菌體均可作為芽孢桿菌的表達(dá)載體。其中Φ105是一種溫和噬菌體。第69頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202369宿主菌：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，因此在構(gòu)建芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)宿主菌時(shí)要將蛋白酶基因進(jìn)行突變，使其滅活或?qū)⒒钚越档?。目前?yīng)用較多的宿主菌主要有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等。第70頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202370枯草芽孢桿菌能分泌6種不同的胞外蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶及中性蛋白酶A和B。對(duì)其中3～5種胞外蛋白酶基因進(jìn)行突變，可將胞外蛋白酶的活性降低至原來(lái)的1％；若將6種胞外蛋白酶基因全部突變，則胞外蛋白酶活性可降至原來(lái)的0.3%左右。第71頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202371短小芽孢桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：1、能對(duì)許多蛋白質(zhì)進(jìn)行分泌表達(dá)2、胞外蛋白酶活性較低3、短小芽孢桿菌分泌胞外蛋白酶的同時(shí)還能產(chǎn)生蛋白酶抑制劑，不同短小芽孢桿菌分泌抑制劑的能力不同，使胞外蛋白酶的活性差異很大第72頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023724、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)由三層組成，最外兩層為蛋白層，內(nèi)層為肽聚糖。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的生長(zhǎng)周期有關(guān)。在生長(zhǎng)穩(wěn)定前期，細(xì)胞壁的外層和中層蛋白開(kāi)始從細(xì)胞表面脫落，分泌型蛋白開(kāi)始表達(dá)；進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞壁的蛋白層全部脫落，細(xì)胞壁蛋白仍然表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞壁蛋白在培養(yǎng)基中大量累積。第73頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023735、利用細(xì)胞壁蛋白基因的啟動(dòng)區(qū)、操縱區(qū)、翻譯起始區(qū)和蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列等元件表達(dá)外源基因，可使外源基因在小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效分泌表達(dá)。第74頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202374芽孢桿菌中高效表達(dá)的策略1、提高表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性：以金黃色葡萄球菌為基礎(chǔ)構(gòu)建的一系列質(zhì)粒在進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制時(shí)會(huì)產(chǎn)生許多單鏈DNA，這些單鏈DNA的存在會(huì)對(duì)質(zhì)粒DNA造成影響，在沒(méi)有選擇壓力的情況下易發(fā)生丟失；某些表達(dá)質(zhì)粒載體還含有染色體DNA同源序列，在細(xì)胞分裂的過(guò)程中可發(fā)生同源交換，導(dǎo)致質(zhì)粒的消失。第75頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023752、構(gòu)建新型的表達(dá)質(zhì)粒：通過(guò)消除表達(dá)載體中與宿主菌染色體DNA的同源序列3、構(gòu)建整合型質(zhì)粒：利用質(zhì)粒中與染色體的同源序列構(gòu)建整合型質(zhì)粒，使目的基因整合到染色體上4、滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶第76頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202376鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌是一類好氧、絲狀的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛存在于土壤中，能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。鏈霉菌的染色體為線狀結(jié)構(gòu)，在中間含有復(fù)制起始點(diǎn)和共價(jià)結(jié)合的末端蛋白，DNA不穩(wěn)定，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺失而環(huán)化，但對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有嚴(yán)重影響。第77頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202377鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)；1、為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素2、可進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)3、可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級(jí)代謝途徑和初、次級(jí)代謝調(diào)控體系，表達(dá)外源蛋白的時(shí)間較長(zhǎng)4、鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)第78頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202378鏈霉菌表達(dá)載體啟動(dòng)子：鏈霉菌基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為多樣性，至少存在三類鏈霉菌基因啟動(dòng)子：1、與大腸桿菌基因－10區(qū)和－35區(qū)類似的啟動(dòng)子，－10區(qū)堿基序列通常為5’TAGPuPuT3’，－35區(qū)堿基序列為5’TTGCPu3’，這種啟動(dòng)子序列可被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別，這類啟動(dòng)子一般在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。第79頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023792、僅與大腸桿菌基因－10區(qū)類似的啟動(dòng)子。3、與大腸桿菌基因－10區(qū)與－35區(qū)序列均不相同的啟動(dòng)子。終止子：鏈霉菌基因終止子結(jié)構(gòu)具有較長(zhǎng)的不完全互補(bǔ)反向重復(fù)序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在多數(shù)情況下不含寡聚T序列，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)位于終止子結(jié)構(gòu)下游的鄰近區(qū)域第80頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202380核糖體結(jié)合位點(diǎn)：鏈霉菌基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列類似于其他原核生物的SD序列：5’(a/g)GGAGG3’相對(duì)于其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌而言，鏈霉菌基因中核糖體序列的保守性略低，與起始密碼之間的距離為5～12個(gè)堿基。鏈霉菌基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼區(qū)之間的距離變化也較大，從數(shù)個(gè)bp到幾百個(gè)不等。第81頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202381密碼子：鏈霉菌對(duì)編碼蛋白質(zhì)的密碼子具有明顯的偏愛(ài)性。對(duì)數(shù)十種鏈霉菌蛋白質(zhì)的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白質(zhì)的堿基序列中GC的平均含量高達(dá)73％，密碼子的第一、第二和第三位堿基的GC含量分別為66％、53％和93％。有些簡(jiǎn)并密碼子的使用頻率不足2％。第82頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202382鏈霉菌表達(dá)載體1、高拷貝載體：普遍采用的是pIJ101，在鏈霉菌中的拷貝數(shù)為40～800。通常加入硫鏈絲霉素、紅霉素、紫霉素和新霉素作為抗性選擇性標(biāo)記。pIJ702是pIJ101的衍生質(zhì)粒，含有mel(酪氨酸酶)和tsr基因作為選擇性標(biāo)記。外源基因可插入滅活mel基因，因不產(chǎn)生黑色素而非常方便使用。第83頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023832、低拷貝載體：由SCP2*衍生的質(zhì)粒pIJ922和940等，可接受較大的外源基因，但只有1～2個(gè)拷貝。3、穿梭質(zhì)粒載體：可在大腸桿菌中完成構(gòu)建和復(fù)制，在鏈霉菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。4、噬菌體載體第84頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202384宿主菌：鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌主要有變鉛青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。天藍(lán)色鏈霉菌是整個(gè)霉菌中分子遺傳學(xué)研究最清楚的菌株，但有較強(qiáng)的修飾系統(tǒng)，因而在實(shí)際應(yīng)用中都是以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體菌系統(tǒng)。第85頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202385變鉛青鏈霉菌表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)1、遺傳背景清楚，不含內(nèi)源性質(zhì)粒2、對(duì)外源DNA無(wú)明顯的修飾作用3、能夠高效表達(dá)鏈霉菌基因以外的其他基因；4、具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。第86頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202386在鏈霉菌中高效表達(dá)外源基因的策略影響外源基因在鏈霉菌中表達(dá)的因素包括：?jiǎn)?dòng)子的特性信號(hào)肽的序列基因的結(jié)構(gòu)和發(fā)酵條件等第87頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202387啟動(dòng)子的影響：鏈霉菌RNA聚合酶能識(shí)別某些原核生物的啟動(dòng)子，但不能識(shí)別真核生物基因的啟動(dòng)子，因此表達(dá)真核生物基因時(shí)要采用鏈霉菌的啟動(dòng)子。為高效表達(dá)要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇透脑?。如在啟?dòng)子的－10區(qū)和－35區(qū)內(nèi)插入GC堿基對(duì)可明顯提高外源基因的轉(zhuǎn)錄效率；將ermE啟動(dòng)子中缺失3個(gè)堿基對(duì)，可使基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的效率大大增加。第88頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202388信號(hào)肽序列：針對(duì)要表達(dá)的外源蛋白對(duì)信號(hào)肽序列進(jìn)行優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效分泌表達(dá)的重要途徑。在信號(hào)肽N－區(qū)的電荷數(shù)增加或減少可使分泌表達(dá)的效率成倍的增加或降低；信號(hào)肽與目的蛋白的距離也影響到外源蛋白的分泌。信號(hào)肽只影響分泌與否而不影響表達(dá)的效率。第89頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202389基因結(jié)構(gòu)的影響：1、密碼子的影響：應(yīng)盡可能不出現(xiàn)鏈霉菌中的稀有密碼子。鏈霉菌中翻譯的起始密碼子一般為ATC或GTC,終止密碼為T(mén)AA或TAG。2、SD序列：不同的宿主其SD序列不同，針對(duì)不同的鏈霉菌對(duì)SD序列進(jìn)行改造或修飾以提高外源基因的表達(dá)。第90頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023903、終止子：選擇合適的終止子可提高RNA聚合酶的利用率和增加mRNA的穩(wěn)定性發(fā)酵條件：包括發(fā)酵工藝、培養(yǎng)基組分、各種環(huán)境因素如溫度、pH值和溶氧等一系列相關(guān)條件，這些條件的確定須經(jīng)實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索。第91頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202391藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種很好的表達(dá)系統(tǒng)，藍(lán)藻含有葉綠素和藻膽色素，具有光合系統(tǒng)，進(jìn)行光合作用。藍(lán)藻還具有原核生物的特征，無(wú)細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體DNA裸露，是典型的原核生物。第92頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202392藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)為：1、基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡(jiǎn)單，便于基因操作和外源DNA檢測(cè)；2、細(xì)胞壁為革蘭氏陰性，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化；第93頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023933、營(yíng)光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、CO2、無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度；4、多種藍(lán)藻含有內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件；5、藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無(wú)毒，經(jīng)常作為食品或保健品的添加劑。第94頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202394藍(lán)藻外源基因表達(dá)載體為使外源目的基因的有效轉(zhuǎn)化及表達(dá)，已構(gòu)建了一系列穿棱質(zhì)粒表達(dá)載體和基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，如：pZL、pPKE2、pPKET等。在這些表達(dá)載體上組裝了多種含有不同啟動(dòng)子的基因表達(dá)盒。應(yīng)用較多的有噬菌體PL和PR啟動(dòng)子及藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白cpcB2A2操縱子啟動(dòng)子和熱休克基因groESL等。第95頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202395在藍(lán)藻細(xì)胞中高效表達(dá)外源目的基因的策略1、構(gòu)建在藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定性好的表達(dá)載體系統(tǒng)：現(xiàn)已構(gòu)建了松馳質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒，在細(xì)胞中有較高的基因拷貝數(shù)，提高了目的基因高效表達(dá)的可能性。第96頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023962、重組穿梭質(zhì)粒在藍(lán)藻細(xì)胞中通常是很不穩(wěn)定的，在缺選擇壓力的培養(yǎng)條件下很容易丟失，導(dǎo)致目的基因表達(dá)的不穩(wěn)定性。近年來(lái)以藍(lán)藻染色體DNA的非必需序列區(qū)為基因整合平臺(tái)，構(gòu)建相應(yīng)的供體質(zhì)粒表達(dá)載體，通過(guò)同源重組將目的基因整合到藍(lán)藻染色體上保證其穩(wěn)定。第97頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023973、組裝含強(qiáng)啟動(dòng)子的外源表達(dá)盒。4、外源基因融合表達(dá)：近年來(lái)開(kāi)發(fā)了泛素融合表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)藍(lán)藻、大腸桿菌及酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明，目的基因泛素基因融合表達(dá)可大大提高目的基因的表達(dá)量，并且?guī)缀跛蟹核厝诤闲问疆a(chǎn)生的蛋白質(zhì)都是具有活性的，同時(shí)，泛素還可被作為分離標(biāo)簽。第98頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202398基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化外源基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。因此，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)過(guò)程就是對(duì)特異性mRNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。對(duì)mRNA檢測(cè)的主要方法為Northern雜交法，檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的方法包括生化反應(yīng)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和生物學(xué)活性檢測(cè)法等。第99頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/202399外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞后可能有的命運(yùn)是：1、外源基因與表達(dá)載體一起游離于染色體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄2、外源基因整合到染色體上并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄3、外源基因整合到染色體上后不轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為基因沉默第100頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023100Northern雜交檢測(cè)mRNA步驟：1、提取總RNA2、分離mRNA(利用親和層析的原理純化)3、制備RNA探針。(根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針或以cDNA探針)4、Northern雜交第101頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023101報(bào)告基因的酶法檢測(cè)報(bào)告基因的特點(diǎn)1、表達(dá)產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中不存在2、報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物便于檢測(cè)第102頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023102基因工程中使用的報(bào)告基因：1、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)：催化乙酰輔酶A中的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上而使氯霉素失活。真核生物細(xì)胞中不含CAT，重組后細(xì)胞產(chǎn)生氯霉素抗性。CAT的活性可以通過(guò)反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或乙氯霉素的增加表示。第103頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023103基因工程中使用的報(bào)告基因：2、β-葡萄糖苷酯酶基因(GUS)編碼產(chǎn)物催化β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。大多數(shù)植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和真菌中都不存在內(nèi)源GUS活性而廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因。另外常用的報(bào)告基因有二氫葉酸還原酶、胸苷激酶、熒光素酶等第104頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023104免疫學(xué)檢測(cè)：是基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)中最常用的方法之一。以表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，通過(guò)與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)來(lái)確定基因表達(dá)的情況。主要方法有1、免疫沉淀法2、酶聯(lián)免疫吸附法3、Westhern印跡法4、固相放射免疫法等第105頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023105免疫沉淀法的過(guò)程1、對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記：通常以同位素35S標(biāo)記靶蛋白，在培養(yǎng)基中加入〔35S〕的蛋氨酸和半胱氨酸的混合物，通過(guò)代謝過(guò)程使哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記上放射性同位素。2、細(xì)胞裂解釋放靶抗原3、靶蛋白的免疫沉淀將抗靶蛋白的特異性抗體加入到細(xì)胞裂解液中形成抗原-抗體復(fù)合物并回收。第106頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20231064、將回收的靶蛋白在反應(yīng)試管中與蛋白抗體，使之與靶蛋白結(jié)合并形成沉淀。5、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析第107頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023107酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)1、抗體制備：ELISA檢測(cè)中的抗體包括普通抗體和酶標(biāo)記抗體，其中酶標(biāo)記的抗體又分為針對(duì)特異抗原的酶標(biāo)一抗和針對(duì)一抗的酶標(biāo)二抗2、抗體或抗原的包被：通過(guò)物理吸附法和共價(jià)交聯(lián)法等將抗原或抗體固定在固相載體的表面第108頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/20231083、免疫反應(yīng)：特異性抗原與固相抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)抗體反應(yīng)形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物4、特異性表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：洗去未發(fā)生反應(yīng)的抗體，加入顯色劑或熒光底物，通過(guò)酶促反應(yīng)發(fā)生顏色或熒光強(qiáng)度變化以確定抗原的量。第109頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023109Westhern印跡法1、總蛋白質(zhì)的提取2、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳3、蛋白質(zhì)印跡4、探針的制備(針對(duì)目的蛋白的抗體［一抗］它一般不進(jìn)行標(biāo)記，而與一抗結(jié)合的二抗帶特定的標(biāo)記)5、雜交檢出生物學(xué)活性檢測(cè)第110頁(yè)，課件共117頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5/14/2023110基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化1、細(xì)胞破碎2、