溶菌酶制備及其性質(zhì)鑒定

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫溶菌酶的制備及其性質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，具有抗感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等多種藥理作用。雞蛋清內(nèi)含有豐富的溶菌酶，向雞蛋清中加入一定量的中性鹽，并調(diào)節(jié)pH至溶菌酶的等電點(diǎn)，溶菌酶即可結(jié)晶析出。如若結(jié)晶不純，可以重結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶之所以溶菌，因它能催化革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁黏多糖水解的緣故。測定溶菌酶的活力，可以用某些細(xì)菌細(xì)胞壁作為底物，以單位時間內(nèi)被它水解的細(xì)胞壁的量表示酶活力的大小。實(shí)驗(yàn)步驟一、溶菌酶的提純結(jié)晶（1）將2只雞蛋的蛋清置于小燒杯中，慢慢攪拌5分鐘，使蛋清稠度均勻，然后用兩層紗布過濾除去卵帶或碎蛋殼，記錄蛋清體積。（2）按每100ml蛋清溶液加入5g氯化鈉的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化鈉細(xì)粉，邊加邊攪拌，促使氯化鈉細(xì)粉及時溶解，以避免局部濃度過高或沉淀于容器底部，否則會引起蛋白質(zhì)的變性而產(chǎn)生大量的白色沉淀。實(shí)驗(yàn)步驟（3）加完氯化鈉細(xì)粉后，再用1mol/L的氫氧化鈉溶液小心地將上述蛋清溶液的PH值調(diào)節(jié)到9.5-10.0。低溫下靜置7d，溶菌酶結(jié)晶將慢慢析出，于72-96h達(dá)到最高產(chǎn)率。（4）將結(jié)晶溶液4000r/min，離心5min，傾去上清液，加入等體積預(yù)冷0℃丙酮，再4000r/min，離心5min，洗滌后棄去上清液，即可得到粗制的溶菌酶晶體。實(shí)驗(yàn)步驟二、溶菌酶的活力測定（1）酶液的制備準(zhǔn)確稱取溶菌酶樣品100mg，用0.1mol/L，pH6.2磷酸緩沖液配成1mg/ml的酶液，再將酶液稀釋成50μg/ml。（2）將酶液2mL和底物懸液2mL（短小芽孢桿菌）分別置于25℃水浴中保溫10-15min，然后吸取底物懸液4mL放入比色皿中，450nm波長讀出吸光度，此為0時讀數(shù)。1min后，再讀吸光度，記下讀數(shù)。（3）酶活力單位的定義是：在25℃，pH6.2，波長為450nm時，每分鐘引起吸光度下降0.001為1個活力單位。實(shí)驗(yàn)步驟P={(A0-A1)/m}*1000P：每毫克酶的活力單位（U/mg）A0：零時450nm處的吸光度A1:1min時450nm處的吸光度m：樣品的質(zhì)量（mg）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、計(jì)算出溶菌酶的活力單位2、