原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略(共43張PPT)

原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略第一頁，共43頁。教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略；五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。第二頁，共43頁。四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略

原核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括：

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)等,其中應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。第三頁，共43頁。原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價(jià)格低廉；2、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的水平高(如大腸桿菌中目的蛋白的表達(dá)量可超過細(xì)菌總蛋白量的80%)；3、基因背景和表達(dá)特性清楚。第四頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)自20世紀(jì)70年代以來,大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。尤其是進(jìn)入后基因組時(shí)代以來,有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展,對基因表達(dá)的要求更高,這時(shí)大腸桿菌往往是表達(dá)的第一選擇。第五頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可以高效表達(dá)不同外源基因產(chǎn)物等特點(diǎn),是許多外源基因表達(dá)系統(tǒng)中最好的一種,是目前研究最深入、發(fā)展也最完善的表達(dá)系統(tǒng),大量的有價(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中獲得了超量表達(dá)。缺點(diǎn)：大腸桿菌表達(dá)體系與其他表達(dá)體系相比,也具有一些缺點(diǎn):①高效表達(dá)易形成包涵體。②不能進(jìn)行翻譯后的加工修飾,如糖基化、磷酸化及?；取５诹?，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的操作流程

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作的一般程序如下：

獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗(yàn)證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測。第七頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念首先講述一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個(gè)MCS？是我們要特別注意的。

第八頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。

篩選標(biāo)記和報(bào)告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級(jí)細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實(shí)驗(yàn)人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個(gè)單位，青霉素劑量似乎越來越大了。

第九頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念對于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報(bào)告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報(bào)告基因了（注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶，熒光素酶等等。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。

啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)：

啟動(dòng)子：啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子。

轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用——控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是Rho因子作用下使mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。常見的是rrnB

、rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。

第十頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念

核糖體結(jié)合位點(diǎn)：啟動(dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補(bǔ)的SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。

第十一頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長，反過來影響表達(dá)量的積累。

誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

第十二頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長，或者形成包涵體，而且表達(dá)產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。

可溶性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。第十三頁，共43頁。提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如Takara的ChaperoneplasmidSet）；（2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達(dá)含可溶性多肽或信號(hào)肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。第十四頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子最早應(yīng)用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的是Lac乳糖操縱子，由啟動(dòng)子Plac、操縱基因lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO

上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。第十五頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株。第十六頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開啟轉(zhuǎn)錄。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn)定。

第十七頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子以λ噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子受控于λ噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR

表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達(dá)系統(tǒng)，就是將受trp啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動(dòng)子，抑制cI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL啟動(dòng)子的抑制。

第十八頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍——當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。

第十九頁，共43頁。常用的幾種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系列，特點(diǎn)：使用該系列載體可以很方便進(jìn)行下一步重組蛋白的純化。

第二十頁，共43頁。GE（原安瑪西亞）-pGEX系列第二十一頁，共43頁。Invitrogen-Champion?pETExpressionSystem等四個(gè)系列比起其它公司的原核表達(dá)系列來說Invitrogen有個(gè)非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。像之前Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，但是Invitrogen的表達(dá)系統(tǒng)大量運(yùn)用了它的TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)。Invitrogen公司總共有四個(gè)原核表達(dá)系統(tǒng)它們分別是：Champion?pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。這四個(gè)系列的載體可謂把原核表達(dá)的發(fā)展史中出現(xiàn)過的幾種啟動(dòng)子都囊括進(jìn)去了，包括T7、pL、pBAD和trc啟動(dòng)子，同時(shí)幾種經(jīng)典的調(diào)控方式也都出現(xiàn)了，包括有乳糖操縱子、色氨酸操縱子和阿拉伯糖操縱子。Champion?pETExpressionSystem之所以取了個(gè)冠軍系統(tǒng)的稱號(hào)是因?yàn)樗Y(jié)合了經(jīng)典的T7表達(dá)系統(tǒng)和Invitrogen的王牌定向TOPO技術(shù)及Gateway技術(shù)，這可謂是強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手。

第二十二頁，共43頁。第二十三頁，共43頁。第二十四頁，共43頁。InvitrogenpET100/D-TOPO載體圖譜第二十五頁，共43頁。Novagen公司-pET表達(dá)載體序列Novagen公司（Merck的子公司）出品了多種原核表達(dá)載體系列，其中的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體。第二十六頁，共43頁。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個(gè)常用的啟動(dòng)子通常，載體很貴，我們可以通過實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。第三十五頁，共43頁。偏好的密碼子（需要重新合成基因），第二十五頁，共43頁。啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)：

啟動(dòng)子：啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。第三十五頁，共43頁。原核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括：現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。特別是在大量抽提過程中。解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標(biāo)簽的pET載體，例如pET28和pET30序列載體。Novagen公司（Merck的子公司）出品了多種原核表達(dá)載體系列，其中的pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。特別是在大量抽提過程中。另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。Novagen公司的pET表達(dá)載體系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.coli

pET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus?Tag?)proteinpET-44a-cwithNus?Tag?sequenceplusN-andC-terminalHis?TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis?Tag?sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis?Tag?sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacI

pLysEandpLysS

第二十七頁，共43頁。Novagen公司的PET32a表達(dá)載體圖譜第二十八頁，共43頁。Novagen公司的pET表達(dá)載體選擇從開始涉及表達(dá)的時(shí)候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇，Novagen公司僅提供三個(gè)載體：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加標(biāo)記外源蛋白都會(huì)以不溶的包涵體形式表達(dá)。為了讓外源蛋白融合表達(dá)一般說來有三個(gè)策略：1.與一個(gè)高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達(dá)，比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.轉(zhuǎn)入一個(gè)酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白，DsbA，DsbC。3.插入一個(gè)定位到周質(zhì)空間的信號(hào)肽序列。以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用pETBlue系列載體。在重組技術(shù)上，Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式：Ligation-Independentcloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個(gè)突出的堿基以在退火時(shí)和目的片斷互補(bǔ)。在設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物時(shí)加入與LIC載體互補(bǔ)的序列，PCR產(chǎn)物用3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補(bǔ)的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。第二十九頁，共43頁。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表達(dá)使用的菌株，為了提高表達(dá)量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個(gè)種類：1.蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，這包括有B834,BL21,BLR,Origami?B,Rosetta?和Tuner?。因此在純化時(shí)可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。2.保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá)Tuner?株及它的衍生株（Origami?B和Rosetta?）是BL21菌株的lacY1缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或者大量表達(dá)。一般說來，低濃度表達(dá)有利于蛋白的可溶性和活性。第三十頁，共43頁。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3.二硫鍵形成與溶解性增強(qiáng)二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也專門設(shè)計(jì)了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami?。在這些菌株中表達(dá)蛋白，可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。4.稀有密碼子的補(bǔ)給不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當(dāng)這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時(shí)候，就會(huì)造成蛋白表達(dá)量極低，或者翻譯提前終止。Rosetta?是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。5.硒蛋氨酸標(biāo)記B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。第三十一頁，共43頁。原核表達(dá)需要考慮的問題在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達(dá)效果。第三十二頁，共43頁。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá)策略1、采用高強(qiáng)度啟動(dòng)子-如T7啟動(dòng)子；2、將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌偏好的密碼子（需要重新合成基因），或采用含有大腸桿菌稀有密碼子tRNA

的Rosetta系列菌株。3、采用豐富培養(yǎng)基（如TB）代替普通的LB培養(yǎng)基；4、優(yōu)化大腸桿菌的生長條件和目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)條件。第三十三頁，共43頁。使用pET表達(dá)系統(tǒng)的常見問題分析

幾個(gè)常見問題如下表：第三十四頁，共43頁。原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（1）1、目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。第三十五頁，共43頁。提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合；（2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達(dá)含可溶性多肽或信號(hào)肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。第三十六頁，共43頁。原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（2）2、必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有His-Tag,S-Tag,11個(gè)氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽時(shí)仍能表現(xiàn)出完全的活性。這些肽段都較為親水，理論上都不會(huì)干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導(dǎo)序列才能適合特定的應(yīng)用要求。第三十七頁，共43頁。原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（3）3、如果目的蛋白包含信號(hào)序列，它會(huì)不會(huì)被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因?yàn)榧?xì)胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。除了信號(hào)肽對蛋白質(zhì)的運(yùn)輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)也有影響。因此在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。某些情況下降低誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)溫度至25-30℃，可能提高蛋白運(yùn)輸?shù)谋壤５谌隧?，?3頁。原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（4）4、IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止了生長，是不是表示細(xì)胞死了？回答：T7RNA聚合酶非?；钴S，T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)極強(qiáng)，因此，一旦誘導(dǎo)，細(xì)胞的主要生理活動(dòng)都向著目的蛋白表達(dá)的方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細(xì)胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗(yàn)可以用來檢測表達(dá)系統(tǒng)的性能。但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴(yán)緊的載體/宿主菌組合(比如含有plysE的宿主菌)等，這時(shí)在誘導(dǎo)后菌落還是會(huì)繼續(xù)生長。第三十九頁，共43頁。原核表達(dá)常見的幾個(gè)問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些什么因素會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)水平？回答：（1）mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所有pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一：Rbs