原生質(zhì)體融合育種(共57張PPT)

第一節(jié)微生物原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體：1953年初次用宏大芽孢桿菌制備勝利1955年發(fā)現(xiàn)再生方法微生物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：對(duì)浸透壓特別敏感對(duì)誘變劑的誘變效應(yīng)更敏感失去對(duì)噬菌體的敏感性不受感受態(tài)的影響第一節(jié)微生物原生質(zhì)體育種一、原生質(zhì)體再生育種二、誘變育種三、轉(zhuǎn)化育種四、交融育種五、其他微生物原生質(zhì)體育種一、原生質(zhì)體再生育種~：微生物制備原生質(zhì)體后直接再生，從再生菌落中分別挑選變異株，最終得到優(yōu)良性狀提高的正變菌株原生質(zhì)體再生育種正變率高于常規(guī)育種？制備和再生過(guò)程中相關(guān)要素微生物組成和構(gòu)造改動(dòng)普通選用對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備原生質(zhì)體不需求加遺傳標(biāo)志第一節(jié)微生物原生質(zhì)體育種一、原生質(zhì)體再生育種出發(fā)菌株選擇菌種活化和預(yù)培育原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生高產(chǎn)菌株分別二、原生質(zhì)體誘變育種微生物制備原生質(zhì)體后誘變處置，分別到再生培育基中再生，從再生菌落中分別挑選高產(chǎn)正變菌株二、原生質(zhì)體誘變育種操作：物理誘變劑化學(xué)誘變劑特點(diǎn)：操作繁瑣、技術(shù)要求高再生時(shí)間長(zhǎng)、容易染菌P223擴(kuò)展青霉PF-868原生質(zhì)體誘變第一節(jié)微生物原生質(zhì)體育種三、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種何種方式DNA轉(zhuǎn)化率高？質(zhì)粒第二節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種微生物原生質(zhì)體交融育種：經(jīng)過(guò)人為方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生交融，并產(chǎn)生重組子的過(guò)程。聚乙二醇誘導(dǎo)電場(chǎng)誘導(dǎo)微生物原生質(zhì)體交融育種的優(yōu)點(diǎn)？1、大幅度提高親本間重組頻率2、擴(kuò)展重組的親本范圍3、集中雙親本優(yōu)良性狀時(shí)機(jī)更大14原生質(zhì)體交融技術(shù)的普通步驟交融親本的選擇與標(biāo)志；原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的交融；原生質(zhì)體的再生；交融子的選擇與鑒定；目的菌株的挑選。一、直接親本及其遺傳標(biāo)志的選擇1.營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗性標(biāo)志、熱致死孢子顏色、菌落形狀等留意：多數(shù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株會(huì)影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量2.常把一方滅活后再交融3.可用不同熒光標(biāo)志直接親本3.可用不同熒光標(biāo)志直接親本提取擬南芥葉片的原生質(zhì)體，并轉(zhuǎn)化帶有GFP標(biāo)簽的目的蛋白表達(dá)載體，瞬時(shí)表達(dá)察看目的蛋白在亞細(xì)胞中的定位情況紅色為葉綠體自發(fā)熒光綠色為GFP的熒光。二、原生質(zhì)體制備與再生制備過(guò)程：分別、搜集、純化、活性鑒定、保管去壁方法：1.機(jī)械法2.非酶分別法3.酶法酶法分別原生質(zhì)體：參考圖9.3第二節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔1〕培育基組成放線菌參與亞適量甘氨酸黑曲霉第二節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔2〕菌體培育方式：1.平板玻璃紙法：絲狀菌2.振蕩沉沒(méi)培育法細(xì)菌和酵母菌酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔3〕菌體年齡絲狀真菌菌絲體尖端細(xì)胞放線菌對(duì)數(shù)期到靜止期細(xì)菌對(duì)數(shù)期酵母菌菌體同步化酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔4〕穩(wěn)定劑高滲溶液無(wú)機(jī)鹽：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有機(jī)物：蔗糖、甘露醇、山梨醇絲狀真菌無(wú)機(jī)鹽細(xì)菌蔗糖、氯化鈉穩(wěn)定劑常用濃度：0.3~1mol/L一、直接親本及其遺傳標(biāo)志的選擇第四節(jié)放線菌原生質(zhì)體交融育種〔4〕穩(wěn)定劑高滲溶液二、原生質(zhì)體制備與再生放線菌甘氨酸二、原生質(zhì)體制備與再生殘存菌體的分別；原生質(zhì)體再生的影響要素〔ｐ234〕第七節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種可用不同熒光標(biāo)志直接親本第二節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種再生時(shí)間長(zhǎng)、容易染菌微生物制備原生質(zhì)體后直接再生，〔３〕界面法離心后，原生質(zhì)體在界面熱〔５〕酶解前的預(yù)處置參與某種物質(zhì)，抑制或阻止細(xì)胞壁某種成分合成酵母菌、絲狀真菌巰基乙醇酵母菌EDTA放線菌甘氨酸細(xì)菌亞適量青霉素酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔６〕酶系和酶的濃度細(xì)菌、放線菌溶菌酶真菌蝸牛酶本卷須知：酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔７〕酶的作用溫度和ｐＨ值酶的最適溫度、菌株生長(zhǎng)最適溫度〔８〕菌體密度酶法分別原生質(zhì)體的影響要素？〔９〕酶解方式運(yùn)用培育皿分別效果好分別時(shí)堅(jiān)持良好的通氣條件、適當(dāng)振蕩分別條件經(jīng)實(shí)驗(yàn)可確定如計(jì)算測(cè)定原生質(zhì)體構(gòu)成率第七節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種如何計(jì)算測(cè)定原生質(zhì)體構(gòu)成率？原生質(zhì)體構(gòu)成率=〔A-B〕/A×100%細(xì)菌、酵母菌血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法高滲再生培育基培育法霉菌、放線菌高滲再生培育基培育法二、原生質(zhì)體制備與再生２．原生質(zhì)體的鑒定〔１〕低滲爆破法p233

〔２〕熒光染色法熒光增白劑熒光顯微鏡二、原生質(zhì)體制備與再生３．原生質(zhì)體的搜集和純化〔１〕過(guò)濾法適于絲狀微生物〔２〕密度梯度離心法離心后，原生質(zhì)體上浮〔３〕界面法離心后，原生質(zhì)體在界面〔４〕漂浮法適于細(xì)胞較大的微生物二、原生質(zhì)體制備與再生４．原生質(zhì)體的活力測(cè)定〔１〕熒光素雙醋酸鹽染色法〔２〕酚藏花紅染色法〔３〕伊文思藍(lán)染色法二、原生質(zhì)體制備與再生５．原生質(zhì)體的保管液氮冷藏參與維護(hù)劑，如：二甲亞砜、甘油等二、原生質(zhì)體制備與再生原生質(zhì)體的再生：在高滲再生培育基上，原生質(zhì)體重新合成細(xì)胞壁，恢復(fù)成完好細(xì)胞。參見(jiàn)p234圖9.41.原生質(zhì)體再生的影響要素〔ｐ234〕菌體生理形狀穩(wěn)定劑酶濃度和作用時(shí)間再生培育基組成殘存菌體的分別；再生培育基上冷凝水原生質(zhì)體密度、再生方法二、原生質(zhì)體制備與再生２．再生率及其計(jì)算p236目的：找出最正確的原生質(zhì)體制備和再生條件再生頻率〔%〕=[〔C-B〕/〔A-B〕]×100%三、原生質(zhì)體交融〔一〕原生質(zhì)體交融過(guò)程P236〔二〕原生質(zhì)體交融的影響要素１、交融劑２、溫度３、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性４、無(wú)機(jī)離子〔二〕原生質(zhì)體交融的影響要素１、交融劑化學(xué)交融劑：PEG不同微生物適宜不同相對(duì)分子質(zhì)量的PEG真菌4000-6000細(xì)菌1500-6000物理交融劑：電場(chǎng)、激光〔二〕原生質(zhì)體交融的影響要素１、交融劑電場(chǎng)交融的優(yōu)點(diǎn)：適于動(dòng)植物、微生物細(xì)胞；交融頻率高可在顯微鏡下察看〔二〕原生質(zhì)體交融的影響要素１、交融劑２、溫度20~30℃３、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性４、無(wú)機(jī)離子PEG介導(dǎo)交融鈣離子、鎂離子電場(chǎng)交融糖或糖醇四、交融體再生復(fù)原：再生培育基細(xì)胞壁重建構(gòu)成菌落P239圖9.8四、交融體再生〔二〕交融體的檢出和分別1.利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志選擇交融體雙親原生質(zhì)體的交融體構(gòu)成菌落親本不能在根本培育基上生長(zhǎng)消費(fèi)育種不常用，可用于遺傳研討〔二〕交融體的檢出和分別2.利用抗藥性選擇交融體營(yíng)養(yǎng)缺陷型和抗藥性結(jié)合挑選P240〔二〕交融體的檢出和分別3.用滅活原生質(zhì)體檢出交融體滅活方法：藥物紫外線溫度〔二〕交融體的檢出和分別4.利用熒光染色法親本分別帶上不同顏色熒光交融后直接根據(jù)熒光顏色選出交融體本卷須知：四、交融體再生〔二〕交融體的檢出和分別察看形狀生化目的測(cè)定DNA含量：分光光度計(jì)五、交融重組體檢出與遺傳特性分析〔一〕重組體的檢出和鑒別方法1、直接法圖9.92、間接選擇法圖9.103、鈍化選擇法〔滅活一方原生質(zhì)體〕五、交融重組體檢出與遺傳特性分析〔二〕交融率見(jiàn)表9.2五、交融重組體檢出與遺傳特性分析〔三〕DNA含量及孢子形狀測(cè)定1、DNA含量測(cè)定2、單倍化3、酶活性及孢子體積測(cè)定4、分子生物學(xué)方法六、原生質(zhì)體交融的運(yùn)用1、提高產(chǎn)量或質(zhì)量，合成新物質(zhì)2、改良菌種遺傳特性3、優(yōu)化菌種發(fā)酵特性4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移5、原生質(zhì)體與細(xì)胞核交融6、進(jìn)展遺傳分析第三節(jié)細(xì)菌原生質(zhì)體交融育種細(xì)菌細(xì)胞壁如何降解？P247

第三節(jié)細(xì)菌原生質(zhì)體交融育種1.如何提高細(xì)菌原生質(zhì)體制備率和再生率？〔1〕預(yù)處置：目的改動(dòng)細(xì)胞壁的性質(zhì)〔2〕溶菌酶：〔3〕細(xì)菌生理形狀：對(duì)數(shù)期〔4〕培育基和培育條件：第三節(jié)細(xì)菌原生質(zhì)體交融育種2.建立最正確交融體系PEG相對(duì)分子質(zhì)量：4000~6000濃度：40%~50%交融時(shí)間：30min第三節(jié)細(xì)菌原生質(zhì)體交融育種〔三〕操作方法p251斜面活化兩代液體振蕩培育第四節(jié)放線菌原生質(zhì)體交融育種〔二〕菌體培育及預(yù)處置水解酶：溶菌酶預(yù)處置：加甘氨酸第五節(jié)酵母菌原生質(zhì)體交融育種一、酵母細(xì)胞壁構(gòu)造和遺傳標(biāo)志菌齡對(duì)原生質(zhì)體構(gòu)成影響大親本滅火的方法：紫外線熱藥物第五節(jié)酵母菌原生質(zhì)體交融育種一、酵母原生質(zhì)體制備p259預(yù)處置：EDTA；巰基乙醇蝸牛酶第二節(jié)微生物原生質(zhì)體交融育種〔１〕過(guò)濾法適于絲狀微生物〔二〕交融體的檢出和分別酶法分別原生質(zhì)體：參考圖9.交融后直接根據(jù)熒光顏色選出交融體霉菌、放線菌高滲再生培育基培育法放線菌