植物組織培養(yǎng)原理

關于植物組織培養(yǎng)原理第1頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素細胞全能性和細胞分化

離體條件下器官發(fā)生

體細胞胚胎發(fā)生第2頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月知識點:基本概念：植物細胞全能性、細胞分化、 脫分化、再分化植物離體培養(yǎng)中再生植株有哪些途徑？愈傷組織是如何形成與生長的？植物體細胞胚胎發(fā)生有哪些途徑？影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？第3頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)植物細胞全能性和細胞分化植物組織培養(yǎng)的核心理論：

植物細胞全能性理論（Haberlandt,1902）。第4頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞全能性概述細胞脫分化細胞再分化第5頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月定義：1902年由Haberlandt提出，即植物體細胞在適當?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。

20世紀80年代，每一個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當條件下可表達出該細胞的所有遺傳信息，分化出植物有機體所有不同類型細胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。一、植物細胞的全能性（Totipotency）第6頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月從一個細胞發(fā)育成一個植株第7頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞全能性的證明是通過1958年Steward等胡蘿卜根段細胞體胚發(fā)生試驗及1964年Guha等進行的曼陀羅花藥培養(yǎng)。第8頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞全能性的相對性:

細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產生植物;

動植細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異.第9頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞按照分裂能力分為三類:第一類是始終保持分裂能力,如莖尖、根尖及形成層細胞；第二類是永久失去分裂能力的終端分化細胞，如篩管、導管、氣孔保衛(wèi)細胞等特化細胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的細胞。如表皮細胞及各種薄壁細胞。第10頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月一個植物細胞向分生狀態(tài)回復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。第11頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)細胞類型不同從強到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細胞>厚壁細胞（木質化細胞）>特化細胞（篩管、導管細胞）根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱：頂端分生組織>居間分生組織>側生分生組織>薄壁組織（基本組織）>厚角組織>輔導組織>厚壁組織第12頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物細胞全能性理論是植物組織培養(yǎng)的核心理論。離體細胞具有生命的特征屬性，在全能性的基礎上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細胞經歷脫分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）過程，可形成再生植物。第13頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞全能性脫分化個體再生再分化細胞分裂細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細胞全能性表達的前提，再分化是細胞全能性表達的最終體現(xiàn)。第14頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月植物干細胞：存在于植物頂端分生組織（莖尖和根尖分生組織）的原始細胞團，也存在于形成層等各種次生分生組織中；植物離體胚性細胞定義為植物全能性干細胞。具有再生能力的愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞植物干細胞變異第15頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月擬南芥頂端分生組織中的干細胞第16頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月擬南芥根尖分生組織中的干細胞第17頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月干細胞能夠很好的展現(xiàn)植物細胞的全能性，因此植物干細胞的選擇和誘導是植物離體培養(yǎng)再生技術體系的關鍵環(huán)節(jié)。植物干細胞自我更新再生能力遺傳穩(wěn)定第18頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、定義：分化（differentiation）：是指植物體各個部分出現(xiàn)異質性的現(xiàn)象，體現(xiàn)在細胞分化、組織分化、器官分化三個水平上。細胞分化：指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。是基因選擇性活化或阻遏的結果。細胞分化是組織分化和器官分化的基礎，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實現(xiàn)的基礎。二、植物細胞分化第19頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月2、植物細胞分化的某些規(guī)律和機理（1）細胞分化分為形態(tài)結構分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結構分化之前。（2）植物中細胞發(fā)育的途徑一旦被“決定”（determination），通常不易改變。而離體培養(yǎng)可以通過脫分化而喪失這種“決定”。（3）分化與極性（Polarity）關系密切。第20頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）細胞分裂對細胞分化具有重要作用。特定環(huán)境條件下進行的細胞分裂可以導致特定的細胞分化，由不等分裂形成的分化細胞說明了細胞質在細胞分化中的作用。（5）植物生長調節(jié)劑有明顯調節(jié)作用。如生長素與分裂素比值，高，促進生根；低，促進長芽。（6）染色體和DNA的變化對細胞分化影響比較大。如核內多倍體的形成。（7）生理隔離現(xiàn)象第21頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)離體條件下植物器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成根、芽、莖等器官的過程。不定根、不定芽是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。第22頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月一、脫分化1、脫分化（Dedifferentiation）：也稱去分化，指離體條件下生長的細胞、組織或器官經過細胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結構和功能而恢復分生狀態(tài)，形成無組織結構的細胞團或愈傷組織或不分化細胞的過程。如葉柄基部的薄壁細胞成為離層細胞；傷害導致局部細胞形成愈傷組織。第23頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

脫分化誘導期間會導致細胞膜透性改變，細胞核增大，內質網范圍擴大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質和酚類物質合成活躍等。但目前對于脫分化的機理尚未完全闡明。2、脫分化的機理第24頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）損傷。切割損傷的刺激，促使細胞增殖。（2）在誘導愈傷組織時常加入生長素類，但同時配合細胞分裂素的效果可能更好。（3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細胞分裂。（4）細胞位置。外植體本身的各類細胞可能對培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。（5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會有不同的培養(yǎng)反應。（6）植物種類的差異。一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。3、影響脫分化的主要因素第25頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月組織培養(yǎng)中的再分化包括下面4個水平：細胞水平的再分化組織水平的再分化器官水平的再分化（器官發(fā)生）植株水平的分化（植株再生）二、再分化第26頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞水平的再分化：愈傷組織生長、不斷分裂，分化出不同的細胞類群。主要有薄壁細胞、分生細胞、色素細胞、石細胞、纖維細胞等。第27頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月組織水平的再分化：在高水平生長素條件下，最常見的是微管束（Vasculartissue）的分化。松散的愈傷組織內含大量擬分生組織或瘤狀結構；致密的愈傷組織內組織分化很少，大多由高度液泡化的細胞組成。

第28頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月器官水平的再分化：由分化出的不同組織形成各種器官，如芽、莖、葉、根等。 根據(jù)起源不同，分為兩種類型：直接器官發(fā)生（器官型）：直接從外植體的細胞形成器官原基，然后發(fā)育成器官。間接器官發(fā)生（器官發(fā)生型）：先形成愈傷組織，再由愈傷組織產生不同的器官原基，后形成不同器官。第29頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月植株水平的再分化（植株再生）：根、莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建。先誘導分化出芽，后形成根較好。離體培養(yǎng)中再生植株的主要途徑有：器官發(fā)生胚胎發(fā)生第30頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、影響細胞再分化因素：

從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經過再分化可獲得各種類型的細胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能讓所有植物的活細胞都再生植株。主要原因是：（1）不同植物種類再分化的能力差異很大；（2）對某些植物再生條件還沒有完全掌握。第31頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月三、愈傷組織（callus）培養(yǎng)１、愈傷組織的形成

在細胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細胞往往是異質性的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導期、分裂期和分化期。

第32頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織（callus）原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源于植物體任何器官內各種組織的活細胞。第33頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月黃瓜子房組織經脫分化形成胚性愈傷組織第34頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月誘導期（起動期）：是細胞準備分裂的時期。細胞大小幾不變，內部發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質和核酸。分裂期：外層細胞分裂，中間細胞常不分裂，形成小芯。細胞分裂快，結構疏松，缺少結構，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細胞必分化，及時轉移，其可無限制地進行細胞分裂，維持不分化狀態(tài)（愈傷的繼代）。分化期：細胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細胞。形成過程（三個時期）：第36頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月2、愈傷組織的生長

（1）生長：誘導期后，外植體外層細胞分裂，在組織受傷表面形成一層愈傷組織，細胞數(shù)目迅速增多，表層細胞平均重量下降，體積變小；降低溫度，可以使細胞生長速度減慢，平均大小可增加。（2）質地類型：松脆和致密兩種。高濃度生長素，可使Callus變得松脆；高濃度細胞分裂素，則可使致密。（3）生理生化變化：次生物質合成能力變化，對激素的需求變化等。第37頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月3、愈傷組織的保持–

轉接

在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時間的延長，Callus長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低甚至死亡。所以在此之前，應及時轉接至新鮮培養(yǎng)基上。

主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變；生理因素，細胞或組織內激素平衡的改變，細胞對外源生長物質的敏感性改變。后者可以通過調控培養(yǎng)條件而恢復。第38頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月4、愈傷組織形態(tài)發(fā)生

（1）過程：外層細胞分裂，逐漸減慢并停止；內部較深處的細胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形成微管化組織和瘤狀結構。（2）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生。第39頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月器官發(fā)生體細胞胚胎發(fā)生第40頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織器官發(fā)生的方式：A

先形成芽，芽的基部后產生后根；B

先形成根，根上再出芽；C愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結合起來.第41頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月器官發(fā)生的過程：分為兩種：

經過愈傷組織的器官發(fā)生不經過愈傷組織的器官發(fā)生第42頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月經過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成第43頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月不經過愈傷組織的器官發(fā)生過程有兩種情況： 外植體直接發(fā)生芽 莖尖培養(yǎng)中芽形成第44頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)植物體細胞胚胎發(fā)生一、什么是植物體細胞胚胎發(fā)生？定義：植物離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官產生類似胚的結構，其形成也經歷一個類似合子胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，這種現(xiàn)象稱為植物體細胞胚胎發(fā)生，形成的類似胚的結構稱為體細胞胚或胚狀體。體細胞胚胎發(fā)生具有普遍性，目前已在200多種被子植物上觀察到體胚發(fā)生過程。第45頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月合子胚的發(fā)生過程第46頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月雙子葉植物胚胎發(fā)生：合子－原胚－球形胚－心型胚－魚雷胚－子葉胚單子葉植物胚胎發(fā)生：合子－原胚－球形胚－盾型胚－子葉胚體細胞胚胎發(fā)生與合子胚發(fā)生階段類似，但體胚形成由體細胞（或小孢子等性細胞）形成。第48頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月合子心型胚正在萌發(fā)的體胚

合子胚與體胚比較第49頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、發(fā)生過程：一般分為5個階段：胚性愈傷組織誘導、體細胞胚胎誘導、體細胞胚胎早期分化發(fā)育、體細胞胚胎成熟、體細胞胚胎萌發(fā)和成苗。

雙子葉植物：體胚經過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚到子葉胚等階段。

單子葉植物：與雙子葉植物誘導發(fā)生過程類似，只是在形態(tài)上無魚雷形胚等階段，成熟體胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等結構。二、體細胞胚胎發(fā)生過程 第50頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月挪威云杉體細胞胚胎發(fā)生及體胚生長狀態(tài)第52頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月針葉松體細胞胚及體胚萌發(fā)生長第53頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）胚性愈傷組織，通常較小，近圓形，具有較大的核和核仁，并高度染色，胞質濃厚。典型的胚性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。（2）胚性細胞DNA、RNA以及蛋白質的合成更活躍，淀粉、可溶性糖含量增加，內源多胺含量升高，同工酶和內源激素合成變化明顯。如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍。2、胚性和非胚性細胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異第54頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月3、體細胞胚胎發(fā)生的基因表達機理

植物體胚發(fā)生的過程非常復雜，牽涉到4000多個相關基因，以體胚發(fā)育后期，表達的基因可達1000多個。在植物體胚發(fā)生過程中，會出現(xiàn)與基因表達有關的一系列生物大分子的有規(guī)律變化.如蛋白質含量變化和特異蛋白質（胚性蛋白）出現(xiàn)與消失。由于其復雜性，目前對體胚發(fā)生的機制了解不多。第55頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月三、植物體細胞胚胎發(fā)生途徑1、直接途徑：指從外植體某些部位的胚性細胞直接誘導分化出體細胞胚胎，如子葉、花序、珠心等外植體。DirectsomaticembryogenesisinBrassicanapus第56頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月2、間接途徑:

外植體先脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織的某些細胞重新“決定”為胚性細胞，進而分化出體細胞胚胎。多數(shù)體細胞胚胎通過該途徑形成的。通常包括2個階段：（1）胚胎發(fā)生叢（Embryogenicclump）EC是由液泡小、細胞質濃的小細胞構成。（2）胚狀體的發(fā)育。將EC轉入降低或除去生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。第57頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月SomaticEmbryogenesisInductioninDelonixregia(Boger.)Raf(RoyalPoinciana)第58頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月花椰菜體胚發(fā)育的不同階段第59頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月菊花花瓣體細胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過程的掃描電鏡觀察第60頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月四、體細胞胚胎發(fā)生的機理

1、體細胞胚胎的起源：

起源存在爭論，但絕大多數(shù)體細胞胚胎起源于單細胞。 細胞胚發(fā)生的實質是細胞分化，即細胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導部分基因開放，實現(xiàn)遺傳信息的表達。第61頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、體細胞胚胎發(fā)生機理：

體胚具有兩個明顯特點：極性和生理隔離

極性：單個胚性細胞第一次分裂多為不均等分裂，頂細胞繼續(xù)分裂形成多細胞原胚，基細胞進行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。極性獲得的誘因是激素和外界刺激。

生理隔離：在早期胚性細胞與周圍細胞存在胞間連絲，但是隨著胚性細胞的發(fā)育，細胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（類似小孢子發(fā)生）。第62頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第63頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月3、體細胞胚胎發(fā)生過程中的的生理生化：（1）蛋白質與核酸代謝；（2）多胺代謝變化；（3）糖類、礦質營養(yǎng)變化；（4）內源激素變化；（5）活性氧代謝變化。第65頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素一、植物種類和基因型1、植物種類不同難易程度不同；被子植物比裸子植物容易。2、同一物種不同基因型間存在較大差別。二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)1、發(fā)育年齡：一般幼態(tài)比老態(tài)組織形態(tài)發(fā)生能力高；2、培養(yǎng)器官或組織類型：細胞分裂旺盛的器官較好；3、培養(yǎng)時間和細胞倍性：一般取處于旺盛生長期的愈傷來誘導器官形成；花藥培養(yǎng)（單倍體花粉細胞與二倍體花藥）。第66頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月三、培養(yǎng)基1、營養(yǎng)成分

一般認為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮和K+有利于胚狀體形成，提高無機磷的含量可促進器官發(fā)生。 莖尖培養(yǎng)和芽誘導