藥典微生物培訓(xùn)資料課件

2010年版藥典附錄無菌檢查和微生物

限度檢查方法增修定內(nèi)容新增微生物限度檢查法指導(dǎo)原則一、抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則二、藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則三、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則四、藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則第一頁，共二十八頁。一：藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則⒈目的該指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。⒉藥品微生物的檢驗(yàn)的對象具特殊性；活的生物、分布不均勻、重現(xiàn)性差必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測方法并嚴(yán)格按照藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范要求進(jìn)行試驗(yàn)第二頁，共二十八頁。影響試驗(yàn)結(jié)果的因素1人員2設(shè)施與環(huán)境3檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)與方法4設(shè)備5測量的溯源性抽樣6樣品的處理7檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的控制8檢驗(yàn)報(bào)告⒊藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范包括以下幾個方面人員、培養(yǎng)基、菌種、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行、設(shè)備、文件、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷等第三頁，共二十八頁。人的要求1：人是質(zhì)量控制與管理的主體2：2010年版無菌檢查法增加了對進(jìn)行無菌檢查人員的要求：必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。3;考試上崗問題;檢驗(yàn)人員經(jīng)過考試（理論與操作考試），經(jīng)過技術(shù)負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)取得上崗證方可從事藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)第四頁，共二十八頁。培訓(xùn)內(nèi)容1上崗前指導(dǎo)性培訓(xùn)：生物安全操作知識和消毒知識，衛(wèi)生要求，潔凈區(qū)的使用，保潔與檢測等。2上崗培訓(xùn)：各種有關(guān)微生物的操作技術(shù)（無菌，微生物限度，效價），與各種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)知識，設(shè)施，設(shè)備的使用3繼續(xù)教育提高培訓(xùn)：新知識，新儀器新技術(shù)的使用，國際國內(nèi)先進(jìn)的微生物學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)知識。4質(zhì)量觀念的培訓(xùn)：實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量目標(biāo)，相關(guān)計(jì)量知識的學(xué)習(xí)第五頁，共二十八頁。

⒉培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗(yàn)結(jié)果。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗(yàn)是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。

該指導(dǎo)原則對培養(yǎng)基的制備、儲存、滅菌及質(zhì)量控制進(jìn)行了指導(dǎo)。第六頁，共二十八頁。培養(yǎng)基必須具備五個條件:1含有細(xì)菌生長所需的物質(zhì)：如：水分、養(yǎng)分（氮源、碳源、礦物質(zhì)）2適宜的酸堿性：多數(shù)為pH7.2-7.6，有的為pH5.6-6.8（最常用的溶劑為純化水特殊情況下用去離子水或者蒸餾水）3不含抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)4均質(zhì)透明：便于觀察細(xì)菌生長性狀和引起培養(yǎng)基的變化5嚴(yán)格滅菌，保證無菌。（按生產(chǎn)者提供或者使用者驗(yàn)證的參數(shù)滅菌）第七頁，共二十八頁。

⒊菌種

實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保藏的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，⑴使盡可能減少菌種污染和生長特性的改變。⑵按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性的重要保證。第八頁，共二十八頁。該指導(dǎo)原則對菌種的來源、菌種保藏、菌種的傳代和使用、菌種的管理進(jìn)行了詳細(xì)的說明和指導(dǎo)。第九頁，共二十八頁。菌種代號的意義國內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號是

CMCC（F）或CMCC（B）

CMCC——中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心

B——代表細(xì)菌,F——代表真菌。

大腸桿菌[CMCC(B)44102]

乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

第十頁，共二十八頁。

２、菌種保藏的原則菌種保藏的原理

微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。

第十一頁，共二十八頁。

３、菌種的傳代和使用

⑴工作菌種的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代防止過度的傳代造成菌種變異,工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株.⑵任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認(rèn)。第十二頁，共二十八頁。標(biāo)準(zhǔn)菌株一般是從菌種保藏中心或?qū)I(yè)實(shí)驗(yàn)室購買得到的，用符號S表示。一般可保存5年。

按菌種保藏中心的要求進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)建議的方法如下：

①安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰將安瓿管頂端加熱，滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

②菌株恢復(fù)培養(yǎng)：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯），滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，取約0.2ml菌體懸浮液，移植于指定的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)（3-4ml），然后在建議的溫度下（一般培養(yǎng)溫度32.5℃±2.5℃，18～24h）培養(yǎng)。第十三頁，共二十八頁。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株⑴標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株.冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后,不得重新冷凍或再次使用。采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法，用于菌種的傳代，。甘油冷凍管保藏法一般可保存2年；

第十四頁，共二十八頁。甘油冷凍管保存法甘油冷凍管保存法適用于保存?zhèn)鞔镁N，一般可保存2年。

①將待保存用菌種接種至平板或瓊脂斜面，經(jīng)37℃24～48h培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)輕輕刮

取菌苔，移至預(yù)先裝有無菌蒸餾水的試管中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于1單位麥?zhǔn)媳葷峁堋?/p>

②向已制備好的菌懸液中加入等體積，濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。

③輕輕振搖，使10%甘油菌懸液充分混合，分裝于無菌小試管中，在-30℃條件下貯存。

第十五頁，共二十八頁。工作菌種：工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株保存于半固體內(nèi)或瓊脂斜面培養(yǎng)基中，作為工作用菌種，用符號W表示。一般可保存1～2個月。嚴(yán)格控制傳代次數(shù)，工作菌種不超過五代，凍干菌種→營養(yǎng)肉湯→半固體瓊脂或甘油水100支冰箱保存

（原代）（一代）（二代）第十六頁，共二十八頁。⒋菌種的管理

嚴(yán)格的程序化管理實(shí)驗(yàn)室必須建立菌種保存和使用文件的程序管理制度第十七頁，共二十八頁。菌種的銷毀

1方法：菌種銷毀采用高壓蒸汽滅菌：121℃，20分鐘。

2需及時銷毀處理菌種：①發(fā)生污染或變異的菌種；②超過保存期限的菌種；③使用后的菌種。

第十八頁，共二十八頁。

⒌實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行

⑴實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)計(jì)的基本原則

①具有檢測所需的適宜、充分的設(shè)施條件。②合理的布局與設(shè)計(jì)，具有獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室、輔助區(qū)域各區(qū)域應(yīng)有明確標(biāo)識。③建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

第十九頁，共二十八頁。

⒍建立合理的控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

⑴對進(jìn)出潔凈區(qū)域的人和物建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。⑵消毒劑的配制應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配制，對所用的消毒劑種類應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無菌。

第二十頁，共二十八頁。⑶建立檢樣品傳遞、儲存、處置和識別管理程序。⑷建立帶菌培養(yǎng)物溢出的意外事件制定處理規(guī)程。⑸建立合理的取樣控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

第二十一頁，共二十八頁。

⒎設(shè)備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備與檢驗(yàn)?zāi)芰凸ぷ髁肯噙m應(yīng)的儀器設(shè)備，其類型、測量范圍和準(zhǔn)確度等級應(yīng)滿足檢驗(yàn)所采用標(biāo)準(zhǔn)的要求，設(shè)備的安裝和布局應(yīng)便于操作，易于維護(hù)、清潔和校準(zhǔn)。使用的消毒劑應(yīng)無菌。建立相應(yīng)的操作和維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。第二十二頁，共二十八頁。

⒏文件

文件應(yīng)當(dāng)充分表明試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室里按可控的檢查法進(jìn)行的，一般包括以下方面：質(zhì)量管理文件、程序文件、技術(shù)操作文件。

第二十三頁，共二十八頁。⒐實(shí)驗(yàn)記錄的保存

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的依賴于試驗(yàn)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，包括正確的試驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)記錄、(所有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))，以便確認(rèn)數(shù)據(jù)的完整性。第二十四頁，共二十八頁。

⒑結(jié)果的判斷

由于微生物試驗(yàn)的特殊性，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析時，應(yīng)從各個可能的方面去考慮，不但要假設(shè)被污染，而且要考慮微生物在原料、輔料或試驗(yàn)環(huán)境中存活的可能性。此外，還應(yīng)考慮微生物生長特性。第二十五頁，共二十八頁。

⑷如果依據(jù)分析調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)有錯誤而判實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，那么這種情況必須記錄。實(shí)驗(yàn)室也必須認(rèn)可復(fù)試程序，如果需要，可按相關(guān)規(guī)定重新抽樣，但抽樣方法不能影響不符合規(guī)定結(jié)果的分析調(diào)查。第二十六頁，共二十八頁。微生物單位cfu(colony-formingunits):菌落形成單位第二十七頁，共二十八頁。內(nèi)容總結(jié)2010年版藥典附錄無菌檢查和微生物

限度檢查方法增修定內(nèi)容。⒉藥品微生物的檢驗(yàn)的對象具特殊性。人員、培養(yǎng)基、菌種、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行、設(shè)備、文件、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷等。4質(zhì)量觀念的培訓(xùn)：實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量目標(biāo)，