化妝品舒緩功效-斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞測(cè)試方法（征求意見(jiàn)稿）

ICS：71.100.70Y40T/HPCIA00X-2022化妝品舒緩功效-斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞測(cè)試

方法SoothingEfficacyofCosmetics-ZebrafishNeutrophilTestMethod（征求意見(jiàn)稿）2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實(shí)施廣州開(kāi)發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布#前言TOC\o"1-5"\h\z范圍 3\o"CurrentDocument"規(guī)范性引用文件 3\o"CurrentDocument"術(shù)語(yǔ)和定義 3原理 3儀器設(shè)備 3\o"CurrentDocument"主要試劑及耗材 4實(shí)驗(yàn)方法 ] 5受試物準(zhǔn)備 ;：????，； 6測(cè)試步驟 廳 6結(jié)果計(jì)算 N 7\o"CurrentDocument"測(cè)試有效性驗(yàn)證 二 7結(jié)果相關(guān)性解讀??…'g ，? 7結(jié)果報(bào)告?…二 :. 7附錄A（資料性附錄）??…土 ?' 尹 9附錄B（資料性附錄） ?盤(pán)2 子 10參考文獻(xiàn) 11r/ —冃IJ 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》規(guī)則起草。本文件由廣東省開(kāi)發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣州開(kāi)發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：化妝品舒緩功效一斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞測(cè)試方法1范圍本文件規(guī)定了斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞測(cè)試方法的基本要求。本文件提供一種化妝品舒緩功效的斑馬魚(yú)生物評(píng)估方法，適用于測(cè)試通過(guò)有效抑制中性粒細(xì)胞聚集而達(dá)到舒緩效果的原料及配方的功效評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和測(cè)試方法DB32/T3979-2021實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)飼育技術(shù)條件OECDTG236-2013化學(xué)品測(cè)試規(guī)范斑馬魚(yú)胚胎急性毒性測(cè)試ISO15088-2017污水對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的主性毒性測(cè)試3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)及定義適合于本文件。3.1斑馬魚(yú)胚胎Zebrafishembryo處在依靠卵黃提供能量發(fā)育階段的斑馬魚(yú)胚胎。3.2沒(méi)有心跳Lackofheartbeat一分鐘內(nèi)心臟沒(méi)有跳動(dòng)的魚(yú)胚胎。3.310%致死濃度10%LethaIconcentration,LC10受試物導(dǎo)致10%受試魚(yú)胚胎死亡的濃度。魚(yú)胚胎沒(méi)有心跳則判定為死亡。4原理皮膚在收到刺激或病菌入侵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)紅腫、瘙癢等不適，表現(xiàn)出敏感肌征兆。其中，中性粒細(xì)胞是最主要的免疫白細(xì)胞，作用于吞噬和清除皮膚中的感染或有害物質(zhì)。而斑馬魚(yú)胚胎的中性粒細(xì)胞和人體中性粒細(xì)胞在形態(tài)、生化和生理功能上高度相似，因此斑馬魚(yú)測(cè)試結(jié)果對(duì)人體皮膚功效具有很好的可推導(dǎo)性。應(yīng)用硫酸銅誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎側(cè)線區(qū)域神經(jīng)丘細(xì)胞損傷而引起中性粒細(xì)胞聚集的模型進(jìn)行測(cè)試，比較受試物處理組和模型對(duì)照組的魚(yú)胚胎側(cè)線區(qū)域的中性粒細(xì)胞的數(shù)量變化,計(jì)算中性粒細(xì)胞抑制率以評(píng)價(jià)原料、配方或產(chǎn)品的舒緩功效。5儀器和設(shè)備5.1斑馬魚(yú)養(yǎng)殖設(shè)備設(shè)備需配有溫控裝置，水循環(huán)和過(guò)濾裝置，養(yǎng)殖容器用玻璃或常見(jiàn)食品級(jí)PC材質(zhì)制成?？刹捎猛ㄓ冒唏R魚(yú)養(yǎng)殖設(shè)備或按實(shí)驗(yàn)室需求配備魚(yú)缸（如長(zhǎng)寬高45cmX45cmX30cm）。5.2產(chǎn)卵盒/缸由玻璃、不銹鋼或其它惰性材料制成，配備網(wǎng)篩（網(wǎng)格大小為2mmX2mm,由不銹鋼或多項(xiàng)材料組成用來(lái)保護(hù)魚(yú)卵）。5.3水質(zhì)監(jiān)測(cè)設(shè)備pH計(jì)、溶解氧測(cè)定儀、鹽度計(jì)（電導(dǎo)率測(cè)定儀）。5.4分析天平精度0.Img。5.5顯微鏡配帶照相系統(tǒng)，最大放大倍數(shù)應(yīng)大于80倍的體式顯微鏡。方法A中顯微鏡需配帶綠色熒光。5.6測(cè)試容器測(cè)試容器：玻璃或聚苯乙烯測(cè)試容器（如96-孔板，培養(yǎng)皿）。如測(cè)試物可能吸附于聚苯乙烯容器時(shí)（如非極性化學(xué)品），應(yīng)選用惰性材料（如玻璃）來(lái)減少吸附。5.7恒溫箱精度±l°Co5.8豐年蝦孵化器設(shè)備需配有孵化桶，氣管，氣量調(diào)節(jié)閥，氣泵截止開(kāi)關(guān)和止逆閥裝置。9其他常規(guī)測(cè)試儀器和設(shè)備移液管、離心管、玻璃容器（如燒杯、容量瓶等）、旋渦混合紘超聲水拾鍋、離心機(jī)、低溫冰箱、可調(diào)節(jié)移液器和吸頭。6主要試劑與耗材1水符合GB/T6682規(guī)定。6.2甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶劑分析純級(jí)別。6.3親魚(yú)養(yǎng)殖用水稱取4g海鹽溶于10L水配制而成，鹽度為0.25-0.50%。，電導(dǎo)率為500?800卩S/cm,溶解氧＞80%飽和度，pH值6.5?8.5,硬度30?300mg/L（以碳酸鈣計(jì)）。6.4豐年蝦（Artemiasalina）卵豐年蝦休眠卵需干燥避光冷藏。稱取約15g海鹽溶于1L水配制豐年蝦卵孵化水，密度以不超過(guò)4g/L豐年蝦卵為宜。6.5魚(yú)胚胎培養(yǎng)液稱取2940mg無(wú)水氯化鈣，1233mg七水硫酸鎂，630mg碳酸氫鈉，55mg氯化鉀溶于10L水配制而成。pH值6.5?8.5。化學(xué)品均為分析純級(jí)別。采用B法測(cè)試需要準(zhǔn)備下列6.6-6.14試劑。6.6硫酸銅溶液用水配制160mg/L五水硫酸銅（CuSO4-5H2O）儲(chǔ)存液。室溫儲(chǔ)存。工作液濃度為0.16mg/L,用魚(yú)胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.7吲哚美辛溶液用二甲基亞硯配制36mg/L哼噪美辛儲(chǔ)存液。冷藏。工作液濃度為0.0036mg/L哼噪美辛，用魚(yú)胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.8多聚甲醛用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制含有4%多聚甲醛和0.8%氫氧化鈉（NA0H）,pH為7.2?7.4的溶液。冷臧。6.950%和70%酒精溶液用水配制50%和70%酒精溶液。6.10蘇丹黑染色液蘇丹黑儲(chǔ)存液：用70%酒精配制0.4%蘇丹黑儲(chǔ)存液。冷藏。苯酚溶液：將8g苯酚溶節(jié)15mL乙醇溶液，將0.3gM^04-12H20溶解于50mL水中，然后將二種溶液混合配制成苯酚溶液。室溫儲(chǔ)存，半年內(nèi)有效。蘇丹黑染色液是將900皿70%酒精溶液，100皿蘇丹黑儲(chǔ)存液和1應(yīng)苯酚溶液混合而成。用前新鮮配制。6.11PBST配制0.04%TritonXT00于PBS溶液中。室溫儲(chǔ)存。6.12漂白溶液用水配制含有3%H202和1%K0H的溶液。使用前新鮮配制。6.13清透液1用水配制含有20%甘油和0.25%K0H的溶液。室溫保存。6.14清透液2用水配制含有50%甘油和0.25%KOH的溶液。室溫保存。7實(shí)驗(yàn)方法7.1受試生物A法應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚(yú)（Daniorerio）（如：mpo,lyz,mpegl等品系）產(chǎn)卵測(cè)試。B法應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚(yú)（Daniorerio），也可以應(yīng)用來(lái)源可靠（如中國(guó)國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心）的野生型AB品系斑馬魚(yú)（Daniorerio）產(chǎn)卵測(cè)試。親魚(yú)應(yīng)具有較好的繁殖能力-魚(yú)齡以6-12月最佳。傳代盡量使用側(cè)交以保持遺傳多樣性，純品系親魚(yú)繁殖5代后需更換新一批親魚(yú)。親魚(yú)不應(yīng)該有明顯可見(jiàn)的感染和疾病特征，且在2個(gè)月內(nèi)沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)藥物治療。在繁殖產(chǎn)卵測(cè)試前，親魚(yú)應(yīng)在引入實(shí)驗(yàn)室后馴養(yǎng)14天以上。7.2養(yǎng)殖要求7.2.1養(yǎng)殖水溫宜控制在26-28.5°C,室內(nèi)溫度建議控制在20~25°Co2.2養(yǎng)殖密度宜控制在每升水1?2條魚(yú)，以及每日固定的12?16h光照，且需保持良好的過(guò)濾系統(tǒng)。7.2.3每天至少喂食2次，包括至少1次豐年蝦（Artemiasalina'）幼蟲(chóng)，喂食間隔在3小時(shí)以上，避免過(guò)量喂食影響水質(zhì)和清潔度。3產(chǎn)卵要求7.3.1如用產(chǎn)卵缸收集魚(yú)卵，將雄魚(yú)和雌夢(mèng)以2：1的比率為宜在產(chǎn)卵前一天關(guān)燈前1?2h放進(jìn)產(chǎn)卵缸中。由于斑馬魚(yú)偶爾不產(chǎn)卵，建議同時(shí)準(zhǔn)備多個(gè)產(chǎn)卵缸備用。7.3.2為避免基因偏差，將最少3個(gè)產(chǎn)卵缸中收集的魚(yú)卵混合再進(jìn)行挑選備用。若用養(yǎng)殖魚(yú)缸收集魚(yú)卵,收卵盒在產(chǎn)卵前一天關(guān)燈前或產(chǎn)卵當(dāng)天開(kāi)燈前放進(jìn)要收集魚(yú)卵的養(yǎng)殖魚(yú)缸中。7.3.3為避免魚(yú)卵被成魚(yú)所食，收卵盒用惰性網(wǎng)覆蓋。7.3.4交配、產(chǎn)卵和受精在開(kāi)燈后大約30min內(nèi)完成，屆時(shí)可把收卵盒移出魚(yú)缸。7.3.5魚(yú)卵從收卵盒取出后，建議用魚(yú)胚胎培養(yǎng)液清潔魚(yú)胚胎。7.3.6挑選健康的斑馬魚(yú)胚胎；并以200應(yīng)魚(yú)胚胎培養(yǎng)液爭(zhēng)不超過(guò)1尾魚(yú)胚胎的密度于28+TC培養(yǎng)至受精后2天。8受試物準(zhǔn)備1化妝品原料1.1水溶性原料：可用魚(yú)胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測(cè)試溶液。8.1.2非水溶性原料：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機(jī)溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理lOmin,然后加入魚(yú)胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心lOmin。取上清液進(jìn)行測(cè)試。8.2化妝品產(chǎn)品8.2.1水溶性產(chǎn)品：可用魚(yú)胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測(cè)試溶液。建議最高測(cè)試濃度為5g/L。8.2.2非水溶性產(chǎn)品：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機(jī)溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理1Omin,然后加入魚(yú)胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心10min。取上清液進(jìn)行測(cè)試。8.3注意事項(xiàng)受試物測(cè)試溶液需測(cè)試前新鮮配制。測(cè)試濃度需保證對(duì)斑馬魚(yú)的死亡率＜10%（沒(méi)有心跳特征的胚胎界定為死亡）。測(cè)試時(shí)可根據(jù)需要設(shè)置多個(gè)濃度組。9測(cè)試步驟以下測(cè)試步驟是3cm培養(yǎng)皿測(cè)試指引。測(cè)試流程可參見(jiàn)附錄A圖A.挑選健康的受精后3天大的斑馬魚(yú)。9.1測(cè)試分組測(cè)試需設(shè)定模型對(duì)照組（硫酸銅工作液）、陽(yáng)性對(duì)照組（硫酸銅工作液+吲味美辛工作液）和受試物組（硫酸銅工作液+受試物）。9.2模型對(duì)照組設(shè)置隨機(jī)挑選24尾魚(yú)胚胎于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅的魚(yú)胚胎培養(yǎng)液。9.3陽(yáng)性對(duì)照組設(shè)置隨機(jī)挑選24尾魚(yú)胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和0.0036mg/LH引噪美辛的魚(yú)胚胎培養(yǎng)液。9.4受試物處理隨機(jī)挑選24尾魚(yú)胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和受試物的魚(yú)胚胎培養(yǎng)液。放置于28±1°C恒溫箱中培養(yǎng)40?4象寸n。應(yīng)用中性粒細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚(yú)9.5樣本的顯微分析將魚(yú)胚胎使用三部溶液麻醉，側(cè)身擺放。然后放到熒光顯微鏡下對(duì)魚(yú)胚胎尾部鏡下按統(tǒng)一的拍照參數(shù)進(jìn)行拍照。9.6數(shù)據(jù)分析計(jì)數(shù)每尾魚(yú)胚胎從肛門(mén)起四分之三尾部側(cè)線區(qū)域（見(jiàn)附錄B圖B）的中性粒細(xì)胞數(shù)目。10結(jié)果計(jì)算計(jì)算中性粒細(xì)胞聚集抑制率：■C—T抑制率=x100% （1）（1）式中：T一受試物處理組魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞數(shù)目的平均值；C一模型對(duì)照組魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞數(shù)目的平均值。對(duì)受試物處理組中性粒細(xì)胞數(shù)目和空白對(duì)照組中性粒細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行雙尾T檢驗(yàn)，取得，值。11測(cè)試有效性驗(yàn)證11.1測(cè)試判定各測(cè)試組暴露完成后至少90%魚(yú)胚胎存活，否則對(duì)應(yīng)測(cè)試組結(jié)果無(wú)效。

11.2測(cè)試要求每批次測(cè)試須設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞聚集抑制率為正數(shù)且人〈0.05。12結(jié)果報(bào)告12.1ROS清除率受試物在對(duì)應(yīng)測(cè)試濃度下對(duì)中性粒細(xì)胞的聚集抑制率。12.2評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)受試物抑制中性粒細(xì)胞聚集的能力，分析受試物處理組與模型對(duì)照組的檢測(cè)值是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p〈0.05）。1313結(jié)果相關(guān)性解讀在中性粒細(xì)胞聚集抑制率為正數(shù)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（芯0.05）情況下，測(cè)試結(jié)果可作為受試物具有舒緩功效的支持證據(jù)，支持舒緩功效宣稱。附錄A（資料性附錄）圖A.測(cè)試流程圖3天大斑馬魚(yú)卵照片分析、中性28±1C暴露40-45min魚(yú)胚胎固定蘇丹黑染色、漂白顯微鏡拍照、粒細(xì)胞抑制率計(jì)算顯微鏡拍照、照片分析、中性粒細(xì)胞抑制率計(jì)算圖A.化妝品舒緩功效斑馬魚(yú)胚胎中性粒細(xì)胞聚集抑制測(cè)試流程圖附錄B（資料性附錄）圖B.測(cè)試結(jié)束時(shí)斑馬魚(yú)胚胎拍照?qǐng)D示*紅色熒光點(diǎn)即為中性粒細(xì)胞（A法）。*深色點(diǎn)即為染色的中性粒細(xì)胞（B法）。

圖B:斑馬魚(yú)胚胎尾部中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域。參考文獻(xiàn)OECD.TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test[S],OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,2003.T/SHRH036-2021化妝品黑色素抑制-斑馬魚(yú)胚胎測(cè)試方法[S]。T/GDST1-2021斑馬魚(yú)胚胎急性毒性測(cè)試A法和B法[S]。deOliveiraS,Reyes-AldasoroCC,CandelS,RenshawSA,MuleroV,&CaladoA.Cxcl8(IL-8)mediatesneutrophilrecruitmentandbehaviorinthezebrafishinflammatoryresponse[J].JImmunol.2013,190(8):4349-4359.HasegawaT,HallCJ,CrosierPS,AbeG,KawakamiK,KudoA,&KawakamiA.TraisientinHmmatoyresponsemediatedbyinterleukin-16isrequiredforproperregenerationinzebrafishfinfcld[J].Elife.2017?6:e22716.Heny Lo四esCA,貝eMK,&RenshawSA.Zebrafishasamodelforthestudyofneutiophilbiol