免疫組化教程

word文檔精品文檔分享第一章免疫細胞化學根本概念及開展簡史一．免疫細胞化學的根本概念免疫細胞化學〔immunocytochemistry〔或抗體〕的定位和定量的技術。應用免疫細胞化學技術可以在光鏡和電鏡水平觀察細胞膜及細胞內(nèi)某種抗原物質(zhì)的存在。從而為生物醫(yī)學研究生命大分子，特別是那些對細胞化學方法來說尚無作用物或作用物特異性不強的酶、蛋白質(zhì)、激素及受體蛋白等在組織內(nèi)分布、細胞內(nèi)定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強、靈敏度高而又直觀化的原位分析細胞組成物質(zhì)的細胞化學手段。二．免疫細胞化學的開展簡史1941年，等創(chuàng)立了熒光抗體法1959年，Singer創(chuàng)立了鐵蛋白法1966年，Nakane等創(chuàng)立了免疫酶技術1971年，F(xiàn)aulk和Taylor創(chuàng)立了免疫膠體金法1976年，Bayer等提出了親合組織化學法第二章免疫細胞化學相關的組織學和細胞學技術一．取材〔一〕組織標本的取材1.活檢鉗的刃口鋒利，以免組織受擠壓。2.取所需組織：主要病變區(qū)、病灶與正常組織交界區(qū)。必要時取遠word文檔精品文檔分享離病變區(qū)的正常組織作為對照。3.為充分保存組織的抗原性,取材要快，盡量保持組織新鮮。〔二〕細胞標本的取材．印片法應用：活檢標本、手術切除的標本。方法：新鮮標本以最大面剖開暴露病區(qū)，載玻片輕壓病區(qū)，脫落細胞黏附于載玻片上，立即浸入固定液中－10分鐘，取出自然枯燥，低溫保存。優(yōu)點：簡便省時，細胞抗原保存較好。缺點：細胞分布不均重疊，影響標記效果。．穿刺吸取涂片法應用：實質(zhì)器官的病變區(qū)。方法：①穿刺液較少時直接涂片，力求均勻。②穿刺液較多時，穿刺液滴入1－2毫升HanksRPMI1640液〕內(nèi)，輕攪，500rpm離心－10分鐘，棄上清，制成細胞懸液〔2x106細胞/ml,吸一滴于載玻片上，輕涂，干后固定。優(yōu)點：細胞均勻。缺點：細胞易變形。．體液沉淀涂片法①細胞數(shù)多，取一滴直接涂片。②細胞數(shù)少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10分word文檔精品文檔分享鐘，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。．培養(yǎng)細胞①貼壁生長的細胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中。②懸浮生長的細胞：可用離心涂片法制成涂片。．離心涂片機法5~6，1000r/min，2min，50~100l。細胞懸液210考前須知：①防止脫片,②為節(jié)省試劑及便于鏡下觀察和計數(shù)，將細胞集中到直徑5為宜。0.6-1.0cm圓圈內(nèi)，細胞總數(shù)以10③粘液豐富的標本如胃液、痰液等未經(jīng)特殊處理，不宜作免疫組化。二．固定〔一〕免疫組化的固定法選擇最正確固定的標準最好的保存細胞和組織的形態(tài)構造。最大限度的保存抗原的免疫活性。固定有：〔〕物理固定：血膜空氣快速枯燥，凍結枯燥?！病郴瘜W固定：固定方法1.浸潤法〔immersionmethod〕4－24小時。word文檔精品文檔分享2.灌流法(irrigationmethod)麻醉動物，經(jīng)動物左心室主動脈插管，生理鹽水沖洗，注入固定液，組織在30分鐘內(nèi)取材。〔二〕重要的固定液．％中性緩沖福爾馬林雙功能交聯(lián)劑。使組織間相互交聯(lián)，保存抗原于原位。特點是對組織穿透性強，收縮性小，易使組織硬化而浸蠟困難。固定時間不宜過長。．4%多聚甲醛磷酸緩沖液適應性較廣泛的固定液，固定時間不宜過長。．Bouin,s液對組織固定力強且較均勻。比單獨醛類固定更適合免疫組化染色，4C。．Zamboni,s液可用于光鏡、電鏡免疫細胞化學觀察。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對組織的穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。6~18小時。．丙酮用于冰凍切片及細胞涂片的固定。固定較好，對組織穿透性很強，保存抗原的免疫活性較好，染色效果稍差。4C，5－10分鐘，枯燥后低溫保存。．％乙醇word文檔精品文檔分享用于冰凍切片及細胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他試劑混合使用，染色較好。．AAF液：95-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,濃甲醛〕〔三〕固定劑的選擇各種抗原的最正確固定劑的選擇見表。鑒于10%中性甲醛是國際最通用的固定劑，雖然它對保存Ig抗原方面較差，假設采用適宜的蛋白酶消化處理，進一步暴露抗原，結合使用敏感的免疫組化方法，如PAPABC固定時間可適當縮短至16-24小時。免疫球蛋白類抗原可選用含汞類的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃體、淋巴結和骨髓還可用甲縮醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蠟切片，能有效地保存Ig。腫瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)對多種固定均穩(wěn)定。一般可用中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片〕激素類中的多肽類激素宜選用Bouin。組織之中酶和一些組織特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。待測抗原與固定液的關系抗原適用固定液word文檔精品文檔分享細胞外表抗原100%丙酮，95%乙醇，10%福爾馬林，Bouin液免疫球蛋白Zenker固定液,10%福爾馬林，95%乙醇，100%丙酮，酶，蛋白類10%福爾馬林，Bouin液，95%乙醇，100%丙酮肽類激素Bouin液，10%福爾馬林，固定液固醇類10%福爾馬林，Bouin液補體95%乙醇，100%丙酮，10%福爾馬林，Bouin液腫瘤胚胎抗原10%福爾馬林，〔四〕考前須知免疫組化固定方法的原那么是：在保持細胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下，應采用濃度最低的固定液和最短的固定時間。為此，固定組織時應該：．組織新鮮，盡早、盡快固定。．組織塊盡量小(<220.4cm)。．固定液體積大于組織體積20倍以上。．固定后充分水洗，減少固定液造成的人為假象．針對抗原、染色法選擇最正確固定方法。三．包埋和切片法固定的和未經(jīng)固定的組織、細胞以及各種涂片和切片方法均可用于免疫組化，但其效果不同?！惨弧潮鶅銮衅瑆ord文檔精品文檔分享優(yōu)點：是能較好地保持抗原活性(尤其是外表抗原)和酶。冰凍切片簡便快速，省去固定、包埋和切片處理等一系列繁瑣步驟。不利于常規(guī)檢查和長期保存標本，不如石蠟切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片機(Cryostat)，以后者最正確，可制成4~6μm的薄片。組織切片可直接貼附于玻璃載片，或貼附于涂有明膠或histostik(商品粘附劑)的玻璃片上，以減少組織片脫落。為防止冷凍過程中冰晶形成，破壞組織構造和保持抗原，取材后立即將標本浸入深低溫預冷的(干冰容器內(nèi)，－70度)正已烷液內(nèi)驟冷30-60秒，取出后再冰凍切片。切片最好盡快進展組化染色亦可吹干儲存于片盒內(nèi)，外包塑料袋，置于－20度低溫冰箱，一個月內(nèi)使用。置室溫枯燥105-10分(未固定者)，即可進入染色程序。〔冰凍切片OCT包埋，置液氮液面上－20秒，低溫保存?！场捕呈炃衅话愫窦sμm，切片于37度烘烤過夜，可置4度保存。切片前，固定的組織塊需經(jīng)酒精逐級脫水，二甲苯透明，再浸蠟包埋。各步驟時間均不宜過長(1-2小時)，以免組織變脆?！彩炃衅倜撍⑼该髟?C進展。②浸蠟、包埋時石蠟溫度低于600C〔三〕振動切片可把新鮮組織〔不固定不冷凍，或低濃度固定液稍稍固定〕切成word文檔精品文檔分享20~100m厚，漂浮免疫組化染色，檢出陽性部位，后固定，常規(guī)電鏡樣品制備。適于免疫電鏡細胞化學觀察?！菜摹乘芰习袂衅瑑?yōu)點是組織塊可同時用于光鏡切片、半薄切片〔0.5~1.5m〕和電鏡超薄切片。目前常用包埋塑料有兩大類：甲基丙烯酸鹽類和環(huán)氧樹脂類。前者能較好地保存抗原，染色前不必脫去包埋材料，但切片易皺折?！参濉吵∏衅d玻片及蓋玻片的處理和切片的附貼載玻片及蓋玻片的處理①載玻片：清洗液〔酸〕浸泡－24小時，水洗，％酒精浸泡2小時后擦干或烤干。②蓋玻片：清洗液浸泡2小時，或鹽酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。切片的附貼免疫組化染色過程較長，并需用含外表活性劑的緩沖液屢次浸泡切片。有的石蠟切片染色前要用蛋白酶消化。新鮮組織如用灌注法或浸潤法固定后再作冰凍切片會失去粘附性。以上這些因素常常造成染色過程中切片的脫落。要防止這一問題的發(fā)生，常規(guī)的蛋白甘油附貼法已不符合要求。免疫組化染色中可選用的附貼劑。word文檔精品文檔分享(1)甘油—明膠：1%明膠100ml混勻，涂布載破片上，切片附貼后置多聚甲醛蒸氣(80度)甘油12ml中1小時麝香草酚數(shù)滴(2)甲醛—明膠：1%明膠5ml涂布載片上，切片附貼后置37度溫箱中1小時或過夜2%甲醛5ml(3)鉻明礬---明膠：1%明膠與0.1%鉻明礬(硫酸鉻鉀)等量混合后即可涂片。60C晾干。(4)多聚賴氨酸：Poly-L-Lysine0.5%多聚賴氨酸(MW>300，000)水溶液，涂布載片后，晾干或45C烤干，一周內(nèi)應用。此溶液需冷凍貯藏。〔〕：3-AminopropyltriethoxysilaneAPES/丙酮〔1/50〕涂片晾干?！病矨PES和Poly-L-lysine〔PLL〕聯(lián)合應用適于特別容易脫片的情況。第三章免疫細胞化學染色免疫細胞化學的類型根據(jù)標記物的性質(zhì)，可將免疫組化染色法分為以下幾種：(1)免疫熒光法(Immunofluorescencetechnique)(2)免疫酶法(Immunoperoxidasetechnique)(3)親合組織化學法〔affinityhistochemistry〕(4)免疫金銀法(Immunogoldtechnique)(5)其它：放射免疫法。此外，尚有根據(jù)染色及抗體滴加步驟，分類為直接法，間接法，橋法等。word文檔精品文檔分享一．免疫細胞化學染色方法及原理〔一〕免疫熒光技術(Immunofluorescencetechnique)1.免疫熒光直接法原理：優(yōu)點：簡單、省時、特異性強。缺點：一種標記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。2.免疫熒光間接法原理：word文檔精品文檔分享優(yōu)點：一種標記抗體可用于多種一抗〔只要一抗是同種動物產(chǎn)10倍左右。缺點：非特異性著色時機較多；染色時間長。3.雙重免疫熒光標記法標本保存及封片介質(zhì)①及時照相，可－0C暗處保存。②緩沖甘油液〔PH8.5〕0.5mmol/lPH8.5碳酸鹽緩沖液19份混勻即用。熒光顯微鏡標本制作要求①載玻片光潔均勻，厚度，在0.8-1.2mm間，無明顯自發(fā)熒光。有時需石英玻璃載玻片。②蓋玻片光潔，厚度0.17mm左右。③切片不宜太厚。④暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察時，使用無熒光鏡油，或上述甘油及液體石蠟。〔二〕免疫酶標技術(Immunoperoxidasetechnique)1.酶標抗體法通過共價鍵將酶結合在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進展細胞或組織外表或內(nèi)部某種抗原成分定位觀word文檔精品文檔分享察。HRP〔POD〕ALP直接法優(yōu)點：簡單、省時、特異性強。缺點：一種標記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。間接法優(yōu)點：與免疫熒光技術相比，此法終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片可長久保存，反復觀察。word文檔精品文檔分享2.非標記抗體酶法(1)酶橋法word文檔精品文檔分享優(yōu)點：提高了敏感性。(2)過氧化物酶—抗過氧化物酶法〔peroxidaseanti-peroxidasemethod,PAP法〕1970年，Sternbergerword文檔精品文檔分享優(yōu)點：敏感，適合于石蠟切片中微量抗原的檢測。缺點：步驟多，費時，不適合臨床常規(guī)檢驗。〔三〕親合組織化學〔affinityhistochemistry〕word文檔精品文檔分享1.抗生物素(親合素)—生物素—過氧化物酶復合物技術(Avidin-Biotin.-PeroxidaseComplextechniqueABC法)根本原理：．鏈酶親合素－生物素－過氧化物酶復合物技術〔StreptAvidin-Biotin-PeroxidaseComplex，SABC〕根本原理：鏈酶親合素是一種從鏈酶菌StreptomycesAvidinii培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，有四個生物素結合位點，親和力高。是一種接近于更完美的生物素結合蛋白。生物素是一種水溶性維生素〔維生素H可以標記抗體和酶而不影響其活性。鏈酶親合素同一定濃度的生物素化酶混合后，形成鏈酶親合素－生物素－酶復合物。這種復合物至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結合位這種復合物即是SABC。word文檔精品文檔分享市售的試劑盒中SABC的A液和B液合二為一。SABC具有下述特點：．高敏感性。．低背景。．簡便快速。．結果穩(wěn)定。試劑盒分型濃縮型－過氧化物酶即用型－過氧化物酶：SABC濃縮型SABC－堿性磷酸酶(容易克制組織細胞中內(nèi)源性酶的干擾，尤其是血液、骨髓、胃腸等富含過氧化物酶的組織，應用SABC－AP效果較好。)即用型－堿性磷酸酶SABC免疫組化雙重染色試劑盒：(同時采用SABC－POD和－AP試劑盒進展免疫組化雙重染色。)．葡萄球菌蛋白A技術〔StaphylococalProteinA,SP〕．凝集素〔組織化學〕技術凝集素(lectin)無脊椎動物和高等動word文檔精品文檔分享物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅細胞而得名。種類很多，常用的為植物凝集素，如：花生凝集素(Peanutagglutinin)PNAD-半乳糖刀豆素A〔Concanavalinensifomisagglutinin〕ConAD-葡萄糖特點：1〕能識別糖蛋白和糖肽，特別是細胞膜中復雜的碳水化合物構造〔碳水化合物抗原決定簇〕2〕具有多價結合的能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等示蹤物結合，從而在光鏡、電鏡水平顯示其結合部位。一般認為，細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型及反映細胞在分化、成熟和細胞惡變中的變化。凝集素本身不是來源或參與免疫反響的產(chǎn)物，放此講授，是由于凝集素具有某些親合特性，能被免疫細胞化學技術方法所應用。word文檔精品文檔分享(四)免疫金銀法(Immunogoldtechnique)二．免疫組化染色的重要環(huán)節(jié)．選擇最正確的固定方法和制片方法．免疫組織化學中的對照實驗由于影響免疫組化的因素甚多，染色中必須有陽性和陰性對照。①陽性對照片可選用其它組織標本并行固定、包埋、染色，并且經(jīng)該抗體證實為中等陽性反響。②陰性對照片仍用上述一樣程序，證實其免疫反響為陰性。待檢標本上滴加PBS以及同種非免疫動物血清以代替第一抗體，用以檢查抗體的特異性。假設僅滴加第一抗體的標本陽性，說明特異性高。免疫組化對照試驗及判斷標本號試驗組陽性對照陰性對照替代抗體對照結論word文檔精品文檔分享1++－－受檢標本含抗原2－+－－受檢標本不含抗原3－－－－操作錯誤4++++非特異性染色5++－+非特異性反響6+－－－陽性對照差注：①第一批抗血清做一次對照實驗即可。②必須用連續(xù)切片普通染色組進展對照。3.選擇抗體的最正確稀釋度最正確稀釋度可提高染色的陽性率，獲得染色的良好的對比。抗體濃度過高。反而會減弱抗原抗體的結合，甚至出現(xiàn)假陰性結果?？贵w稀釋的原那么是：①抗體的工作滴度(稀釋后的應用濃度)高有助于減少污染蛋白的非特異著色，節(jié)省試劑。②選擇所測抗原著色最強、背景著色最弱的滴度。③根據(jù)抗體和待染標本等具體情況，確定最正確工作滴度。④稀釋液中常用0.01MPBS，但不宜放過久。欲放置抗體長久，可用Tris緩沖液稀釋，或專用抗體稀釋液。直接測定法：其它條件穩(wěn)定，用于測定一抗最正確稀釋度。選擇抗體的最正確濃度一抗稀釋度特異性染色強度非特異性染色背景強度word文檔精品文檔分享1:50＋＋＋＋＋＋1:100＋＋＋＋1:200＋＋－陰性對照－－在1:100與1:200間如上找出最正確稀釋度。棋盤〔方陣〕測定法：欲測知二種以上抗體的免疫反響濃度，可測試比擬9X標本的陽性反響和背景著色。從下表可知，應采用1:20的第二抗體，并進一步在1:50-1:100之間尋得第一抗體的最正確工作稀釋度。抗體的最正確滴度測試表第二抗體第一抗體稀釋度1:501:1001:2001:20++++(++)++(－)+〔－〕1:40++〔－〕+〔－〕+〔－〕1:80+〔－〕+〔－〕+〔－〕注()內(nèi)為背景著色假設應用三種以上抗體的染色法，如PAP法，ABC法，可按上表求得第二、第三抗體的最正確配伍滴度。之后可按商品說明選擇第一抗體滴度，或按優(yōu)選法求得高稀釋度，逐步縮小優(yōu)選X圍，選中最正確滴度。稀釋中，一般常微量加樣品。最常用者為10μl、20μl、50μl、μl、和μl。抗體稀釋后應充分混勻。．抗體的孵育時間word文檔精品文檔分享標本染色比照度愈大。使用高滴度抗體，可將切片置于4度冰箱內(nèi)過夜(約18小時，以增強特異性著色而減少非特異染色，提高比照。為節(jié)省時間，加強反響亦可于室溫下孵育20分鐘，37度下孵育5-10分鐘。假設標本中抗原很強，可適當延長孵育時間。孵育應在濕盒中進展。．其它注意滴加抗體時應適量。以抗體充分覆蓋組織片為準，不可過多或過少。PBS洗滌抗體時應充分，且應防止使用同一PBS容器導致穿插反響。最終標本顯色時，應用光鏡控制和觀察最正確顯色反響和時—15著色為度。免疫細胞化學染色的考前須知①反響的pH值應以接近體液環(huán)境為宜，即組織片與各種標記抗體液應處于同一酸堿度〔pH7.0-7.2〕②為防止非特異沉著和穿插反響，各標記抗體液要在染色前經(jīng)離心去沉淀③要特別注意載玻片是否處于水平位置〔滴染時〕，確保染色液覆蓋整個切面。④染色反響要在保濕容器內(nèi)進展，以防止染色液的蒸發(fā)干涸。⑤染色的抗原抗體反響要在37度或室溫下進展。但對耐熱能力差的抗原，要在4度低溫下延長反響的時間。word文檔精品文檔分享四．免疫組化有關技術〔一〕抗體的保存C保存一年。稀釋后C保存－3天、7天后抗體的保存4效價顯著降低。〔二〕增強特異性染色的方法．蛋白酶消化法①0.1％胰蛋白酶0C水浴。消化5－30分鐘。最常用。用前37②．4％胃蛋白酶37C消化5－30分鐘。．抗原修復高溫高壓組織抗原修復①適用X圍：大量常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的抗原修復，效果優(yōu)于微波法和直接煮沸法。②儀器設備：普通家用壓力鍋。③緩沖液：0.01M檸檬酸緩沖液，PH6.0。④方法：切片水化。緩沖液置于壓力鍋內(nèi)加熱至沸騰，放入切片，繼續(xù)加熱至噴汽〔扣閥至噴汽以－6－2分鐘后，壓力鍋離開熱源、1分鐘后，自來水淋壓力鍋至室溫，開蓋，取出切片，蒸餾水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。word文檔精品文檔分享⑤考前須知：用過的緩沖液棄去。加熱時間不宜太長，否那么背景加深。組織抗原微波修復②儀器設備：家用微波爐，進口微波爐置“DEFROST〞檔。③方法：去除內(nèi)源性酶的切片置入盛有已煮沸緩沖液的耐熱容0C，持續(xù)8－10分鐘。取出容器至器中，繼續(xù)加熱至98－100室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。④考前須知：不可將切片從緩沖液中取出冷卻。組織抗原直接煮沸修復②方法：切片水化。置入盛有已煮沸緩沖液的燒杯中繼續(xù)加熱10分鐘。參加蒸餾水補充水分損失。燒杯離開熱源，置流水槽內(nèi)冷卻至室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。注：一般，對于不太熟悉的一抗染色石蠟切片時，應比擬一下抗原修復、胰酶消化和不做預處理的染色效果。如果石蠟切片無法作出滿意的結果，那么應考慮用冰凍切片。．適宜的抗體稀釋度抗體效價越高，工作液稀釋度越高?？贵w稀釋度越大，孵word文檔精品文檔分享育時間越長。只有高稀釋度時才能防止非特異性背景產(chǎn)生。盡量使用單克隆抗體〔MAB．孵育時間37C，30－60分鐘。40C過夜〔約18小時〕或室溫。．去污劑0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%TritonX-100處理切片，去除脂類，促進抗體進入細胞中。但是濃度過高會破壞細胞抗原和細胞膜構造。．顯色增敏劑過氧化物酶底物中參加氯化鎳、0.1N異吡唑、氯化銨、硫酸鎳銨等可增強顯色敏感度?！踩撤翘禺惾旧蛢?nèi)源性過氧化物酶的消除法在免疫細胞化學染色中，常在非抗原部位出現(xiàn)陽性反響〔非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽性反響〕，稱為非特異性染色，致背景著色過深。非特異性染色，背風光過深其可能原因有：．粘片劑使用不當。．固定(如可因液中殘存的游離醛基所引起)．切片或涂片太厚。．脫蠟不徹底。．未用酶消化處理切片或進展抗原修復。word文檔精品文檔分享．內(nèi)源性酶未阻斷。．標記抗體、I抗的不純；抗體濃度過高，抗體的稀釋度不夠，反響后沖洗不充分。．血清封閉不夠或血清溶血。．洗滌不徹底。10．底物呈色時間過久。11造成。去除非特異染色的方法：．血清封閉加一抗前，用與二抗同種動物非免疫血清封閉組織上帶電荷基團，去除其與一抗的非特異性結合。必要時參加2－％牛血清白蛋白。也可用除制備一抗以外其他動物非免疫血清。室溫或37度，30分鐘。．緩沖液洗滌用緩沖液參加0.9%NaCL成為高鹽溶液，充分洗滌切片。．盡可能高地稀釋一抗。在組織中的紅細胞、粒細胞含有較多的內(nèi)源性過氧化物酶，word文檔精品文檔分享其它細胞和組織中也有少量。為此，實驗中設法消除或抑制內(nèi)源性過氧化物酶。去除內(nèi)源性過氧化物酶的常用方法：3％HO2蒸餾水或PBS，或％H2O2甲醇，室溫30min處理切片。去除內(nèi)源性生物素的常用方法：生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)中所產(chǎn)生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細胞內(nèi)，在應用ABC法，LSAB法，SP法SABC法染色時會與抗生物素結合而產(chǎn)生非特異性染色。和肝、腎、腦等組織的石蠟切片，在應用上述染色方法前應預先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min除內(nèi)源性抗生物素結合活性，每次作用后用PBS洗5min3次。內(nèi)源性生物素封閉試劑：AvidinBiotinBlockingReagent(ABB)(市售)〔四〕顯色時間的控制①著色太深可減少反響時間。②過氧化物酶顯色時，HO2濃度較大使顯色反響過快而致背景加深，過量H2O2又抑制酶的活性，故HO2濃度要適中。五。免疫細胞化學染色結果判定陽性細胞①陽性細胞染色分布類型：word文檔精品文檔分享胞漿細胞核細胞膜word文檔精品文檔分享②陽性細胞分布呈現(xiàn)灶性彌漫性。③陽性細胞染色強度不一。假設細胞間染色強度一樣，常常提示為非特異性反響。④陽性反響定位于細胞，且與陰性細胞相互交雜分布。而非特異性反響常常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。word文檔精品文檔分享⑤切片邊緣、刀痕、皺折處或壞死擠壓的細胞區(qū)、膠原結締組但不能用于判斷陽性。染色失敗的原因假陰性①固定方法不對，抗原在石蠟切片中遭到破壞，尤其是不標準的石蠟標本。②未加一抗，或一抗與試劑盒中二抗不配對，或抗體失效，或抗體的濃度過低。③抗體孵育時間太短。④染色過程中切片枯燥，或未嚴格按照步驟操作如抗原修復和消化等預處理不當。⑤酶底物中HO2量少或失效。⑥復染或脫水劑使用不當。假陽性①粘片劑太厚。②局部多克隆抗體特異