CR實驗室檢測技術(shù)

PCR實驗室

檢測技術(shù)寧夏動物疾病預(yù)防控制中心2011.08.04

PCR檢測技術(shù)

一、PCR技術(shù)原理

DNA在細胞中的復(fù)制是—個比較復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無機離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等。

PCR是在試管中進行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火)、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，反復(fù)進行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴增。將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下一般都可見到DNA的特異擴增條帶。二、PCR技術(shù)工作流程及注意事項

（一）PCR實驗室的布局

PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增，應(yīng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應(yīng)重點考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測的實驗室要進行功能區(qū)域劃分，從對環(huán)境要求的嚴格程度和功能上可將PCR整個實驗流程劃分為四個區(qū)域：1.配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)）2.模板提取區(qū)3.PCR擴增區(qū)4.電泳區(qū)

（二）各區(qū)操作注意事項下述操作在該區(qū)進行：儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。在本區(qū)的實驗操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。1.配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)）2.模板制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進行：標(biāo)本保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。3.擴增區(qū)下述操作在該區(qū)進行：DNA或RNA擴增。不能從本區(qū)再進入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動。4.電泳區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)如采用負壓或減壓情況下可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。

（三）PCR實驗室設(shè)置的原則

注意：唯一流向制度問題：要求物流、人流均應(yīng)嚴格遵守1→2→3→4路線，嚴禁倒流。

物品的專用與移動問題：移液器、吸頭和離心管等為PCR專用，各區(qū)之間勿串用三、PCR操作程序一是PCR擴增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取二是PCR擴增，即目的基因特異擴增過程三是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段*PCR模板的提?。ㄒ唬悠返牟杉扒疤幚砘钋?，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2mlPBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。組織臟器，取待檢樣品0.05g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加2mlPBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。血清、血漿、乳汁、精液或組織滲出液，則直接取用。

（二）提取模板提取病原微生物基因組是PCR操作成功關(guān)鍵的一步，特別是病原RNA的提取顯得非常重要。一般分為兩步：1.裂解病原微生物，使病原基因組從病原體溢出。2.純化病原基因組，去除蛋白質(zhì)和一些鹽類。（三）病原微生物基因組提取注意事項1.RNA提取應(yīng)注意RNA酶（RNase）污染問題，RNase是一種不怕熱和不易降解的蛋白質(zhì)，而且廣泛存在于我們工作環(huán)境中，對于此酶污染的防治辦法主要有兩方面：①在提取RAN試劑中加入一些RNase抑制劑②操作過程中保持環(huán)境干凈、密閉、戴口罩手套操作等。2.在病原微生物基因組提取時，由于是微量，幾乎看不見。所以當(dāng)離心機離心沉淀RNA和DNA時要記住離心管方向，加入乙醇洗沉淀時要緩慢加入，避免沖掉已提取出來的模板。溶解沉淀時要沿著沉淀部位進行溶解。3.在病原微生物基因組提取時，應(yīng)注意實驗室環(huán)境污染和操作人員安全防護。（四外）實些驗器毒材必須算使用PC油R專用傳吸頭試劑景盒的兇運輸牽和貯奧存PC止R試劑揭盒在瘡適當(dāng)茂的貯老存溫策度下辜的有齊效期衫一般議為6個月核酸梳擴增債部分照的試礎(chǔ)劑一鉗般要料貯存蒼于-2理0℃產(chǎn)物蒜檢測枕部分鋒試劑菊則貯概存于2～8℃。*PC賭R擴增（一）PC敬R反應(yīng)標(biāo)體系剪組成①PC汁R緩沖落液(含Mg2＋)②模板③4種dN臺TP④引物⑤Ta騾q酶（二熔）PC治R擴增孟程序澆：擴增桿程序濱實際龜上是屆一個3種不鳥同溫噸度的擁熱循變環(huán)程芳序。蚊包括鑼①高溫直變性：將爬病原怪微生趙物基攝因模撤板94午℃條件幕下，護使得斤雙鏈DN膀A分子衡變成渠單鏈DN屬A。有姨利于坑下一智步的擦引物晶結(jié)合讓。②低溫床退火：在40苗℃至60足℃條件鄙下，雖使引貪物與枯單鏈DN嘆A結(jié)合優(yōu)的過過程。轟便于因下一址步新DN涌A鏈形厘成弄③適溫替延伸春：在72拜℃條件浴下，你沿引綱物合團成新袍的DN妖A鏈。在這3個溫歪度條里件下啞循環(huán)30至35次，截可將滿病原煩微生和物特掘定的DN逆A片段寺放大賣百萬姨倍。（三泡）PC歇R擴增斧注意熔事項試劑眼：盡崗量分余裝，頸不要每原瓶紀多次脈取用自。加入疼模板值切忌嶄噴霧烈污染堵，在閃吸取坊液體需時，菌盡量感避免徒用力德過快夾吸取凍。避春免反杏應(yīng)成檢分或段模板黃噴到巨移液塔器上殺，污李染移割液器適和環(huán)使境。補所有展非即調(diào)用管忠都應(yīng)版蓋嚴賤。加枕模板DN芒A后應(yīng)籍更換百手套尾。*瓊脂湯糖凝常膠電湊泳分至析擴增刷基因姥片段臺需要挪進行囑瓊脂獵糖凝污膠電餅泳分貿(mào)析，旅依據(jù)勉擴增DN賴A片段蔑在電罷泳中氣遷移宋的距嚴離判醒定其誤大小般，與著已知汗擴增哥基因著片段偉相比抬較來澤判定PC絨R擴增飾效果燃。在進航行瓊孝脂糖箭凝膠命電泳秀分析扛時，芬一般半情況魔下先摧在凝厭膠中洪加1%溴化賓乙錠雨（EB節(jié))(每10脖0m程l加10狠ul窩)然后局將已淋經(jīng)制墨備好喊的1%感-2垂%瓊脂己糖凝耀膠（再用電仙泳緩罩沖液恰配制亞）放伙入電場泳槽褲內(nèi)，塊加入胃待檢什樣品換，同乒時用尸分子用量標(biāo)垃準(zhǔn)品魯作標(biāo)滲記。貧待檢溝樣品指進入墊凝膠激內(nèi)溴默酚藍煎遷移2-塞3c資m后，粥切斷尋電源妻，取榜出凝慶膠在交紫外電燈下棒觀察劑結(jié)果誦。由于EB可與彼雙鏈DN謎A形成逢結(jié)合捏物，強在紫棒外燈帖下能絮發(fā)射瘦熒光負，使EB的熒腥光強貼度增是強80漿-1祥00倍，蠻所以衰，電閥泳后使凝膠您在紫播外燈利下可惱直接齒觀察社。電泳辨所需侮試劑瓊脂盤糖溴化浩乙錠電泳噴緩沖李液上樣抬緩沖森液Ma沿ck若er電泳深槽電泳察儀凝膠超成像慢系統(tǒng)PC廳R結(jié)果秋。1、對秋照(無模拆板)；2－6、PC濕R產(chǎn)物欲（5u欲l樣品汗）瓊脂于糖凝粘膠電卡泳分爪析注淹意事快項電泳櫻上樣環(huán)時避燒免PC金R產(chǎn)物尿漂移明到其況他孔哄而影技響結(jié)嘩果判扒定。用電印泳緩溫沖液在制備貧瓊脂廈糖凝瘦膠。溴化逮乙錠稍（EB）為癥強致旦癌物犯質(zhì)，庫必須欺戴手思套謹躍慎操韻作，帆搖動畝時不足要外曬濺。四、PC雙R檢測叮常見挪問題必與解脊決途豆徑利用PC遲R方法呢檢測膚時，時經(jīng)常歷出現(xiàn)衡假陽遺性、錄假陰代性、饑非特勁異性儉擴增圓和涂蹦抹帶芬。尤正其是向假陽料性和患假陰頑性可濤使檢快測結(jié)徐果得瓣出錯痰誤結(jié)遵論，志有時金可造杰成嚴氏重后毛果。辣為了溫提高帶檢測知的準(zhǔn)我確性都和可扇靠性師，PC置R檢測齊應(yīng)盡跡量減汗少假坦陽性號、假傾陰性些、非同特異趙性擴跨增和雙涂抹遙帶現(xiàn)些象的錢發(fā)生逆。一清個好閣的PC袋R方法遼不但受要求賢特異鳴性好待、靈微敏度閃高、風(fēng)還要駁求具喇有高皆的可忠重復(fù)縱性、炭重現(xiàn)肆性，剩盡量行減少姐假陽叛性、片假陰揭性和榆非特伐異性石擴增型。（一華）假種陽性捎：造成叫假陽拜性的是原因1.樣品碗間交騎叉污蔽染：考樣本蜜污染郊主要及有收素集樣天本的抗容器事被污膨染，繞或樣笨本放異置時經(jīng)，由勒于密內(nèi)封不障嚴溢哥于容帳器外眼，或鄰容器合外粘碌有樣彈本而縱造成第相互屢間交盞叉污匆染；搜樣本胳核酸康模板效在提拘取過都程中些，由彎于吸坐樣槍炕污染沿導(dǎo)致憶標(biāo)本商間污姜染；2.瞎P架CR試劑君的污攜染：狠主要僵是由穴于在PC眠R試劑傳配制勾過程蔑中，接由于瀉加樣塊槍、俗容器殺、雙莊蒸水逗及其懼它溶洪液被PC例R核酸乏模板視污染路。3.艱P毅CR擴增休產(chǎn)物餡污染侄：這賭是PC或R反應(yīng)與中最相主要頁最常筆見的予污染煙問題亂。因滑為PC船R產(chǎn)物余拷貝費量大(一般浪為10男13拷貝/m途l)，遠握遠高不于PC淋R檢測頓數(shù)個株拷貝伯的極孔限，柿所以趨極微偵量的PC核R產(chǎn)物扯污染桐，就酸可形膀成假漠陽性提。4.氣溶鳳膠污練染：向在空胳氣與珠液體馳面摩常擦寺時就怒可形雁成氣弱溶膠捎，在裂操作竭時比毛較劇豆烈地澤搖動稅反應(yīng)論管，爺開蓋招時、擇吸樣敲時及計污染蟻進樣訴槍的傘反復(fù)致吸樣毅都可斧形成因氣溶勢膠而理污染禮。據(jù)做計算決一個股氣溶導(dǎo)膠顆魄?？勺泻?8閣00榴0拷貝認，因叢而由綢其造況成的坊污染聯(lián)是一五個值聽得特館別重楚視的憂問題紅。假陽塊性問反題的歇試驗粉控制在每吸次PC拴R檢測職時，償一定匹設(shè)立度陰性住對照殲樣品沸和陽串性對挨照樣友品?；痍幮灾硨φ論駱悠房箼z測葡為陰南性時構(gòu)，表御明試銳驗全歪部過卡程的榨試劑哄沒有停受到戰(zhàn)污染喉；陽義性對纖照樣活品檢梁測為鋤陽性鑄時，碧表明DN厲A提取抵（RN燦A提取赤、RN肉A反轉(zhuǎn)烏錄）咐、DN肆A擴增賭和電奇泳鑒爸定工陸作體攜系正惡常。室在陰垃性對臂照樣狗品和怠陽性雜對照話樣品招檢測途結(jié)果湖成立見的前究提下楊，才美能對圈檢測沃樣品天進行湊判定毒。只諒有設(shè)擁立試爺驗全靈程的變對照寸，才纏能證惠明試版驗結(jié)嬸果成單立。（二目）假譜陰性如果懼實驗病中設(shè)練置的史陽性預(yù)對照工未能垃擴增阿成陽包性結(jié)滴果，頁提示話本次儉實驗垮中可買能有園假陰閱性結(jié)充果。參但這給里應(yīng)墨注意漂，許擋多國掛產(chǎn)PC冠R試劑塘盒中看陽性撈對照社采用腫質(zhì)粒DN艦A，和帖標(biāo)本住相比喊來說叛，不呆需純豪化提癥取核拖酸的租步驟好，因風(fēng)此，氏如果央在標(biāo)澇本核塔酸純訂化提置取步滴驟有廣問題逐，即茅使陽旦性對屆照均儲呈陽吧性，炮標(biāo)本揚檢測嘆中還塊可能鄉(xiāng)豐有假刮陰性著。造成丈假陰申性原妻因：1.儀器王因素2.試劑配質(zhì)量故問題3.核酸費模板群問題：模板報中含羨有雜坡蛋白漁質(zhì)；座模板咬中含拍有Ta跟q酶抑租制劑湯；模懲板