生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第二十章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

1第二十章

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology2第一節(jié)

分子雜交與核酸印跡技術(shù)MolecularHybridizationandNucleicAcidBlotting4578一、Southern印跡可用于分析基因

拷貝數(shù)的變化由E.M.Southern在1975年提出可用于分析基因拷貝數(shù)的變化基本操作過程包括待測DNA樣品的制備和基因探針的標(biāo)記；待測DNA樣品的電泳分離；電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉(zhuǎn)移、固定到合適的固相支持物；特異性核酸探針與膜上DNA片段雜交，放射自顯影或顯色檢測目的DNA的存在。

9Southern印跡分析基本流程濾紙NC膜凝膠濾紙電泳 轉(zhuǎn)移雜交，顯影酶切DNA樣品上樣 DNA印跡重物緩沖液10二、Northern印跡和RT-PCR可用于

分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化Northernblot是將RNA從凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，定性分析mRNA的常用方法；RT-PCR是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、再以cDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，進(jìn)行RNA定性或定量分析的一種方法；二者均可用于分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。11三、原位分子雜交技術(shù)可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析原位雜交（insituhybridization，ISH）即利用分子雜交技術(shù)來進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)；可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析。12（一）利用原位雜交技術(shù)進(jìn)行基因定位分析熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）基因組原位雜交（genomeinsituhybridization，GISH）13FISH箭頭所示為雜交信號，結(jié)合帶型分析可判斷染色體位置14（二）利用原位雜交技術(shù)確定特定基因的

表達(dá)定位RNA原位雜交

整體原位雜交（Wholemountinsituhybridization,WISH）

15第二節(jié)

PCR技術(shù)的原理和應(yīng)用PolymeraseChainReaction體外高效、快速、特異地擴(kuò)增目的基因或DNA片段的技術(shù)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)(Mg2+)和DNA變性、復(fù)性(退火)及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增.一、PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技術(shù)的工作原理目錄DNA變性復(fù)性延伸Cycle3555555

555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cyclen理論上可達(dá)2n個拷貝原料（pg）

產(chǎn)物(μg)體外高效、快速、特異

地擴(kuò)增DNA片段g→mg→ug→ng→pg2021222324三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。25mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18逆轉(zhuǎn)錄酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA2627實(shí)時PCR技術(shù)的原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'