第三章免疫學檢測技術

第三章免疫學檢測技術韶關學院生科院易道生內容掌握抗原抗體反應的原理與特點，了解抗原抗體結合力和比例。掌握免疫組化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的選擇與使用。掌握酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）反應的原理方法。掌握免疫印痕（Westernblot）的技術原理與方法。了界放射免疫檢測技術（RIA）的原理與方法。目標：掌握ELISA、IHC、Westernblot的操作方法免疫學檢測技術就是利用抗原和抗體高度特異性結合的原理和方法，檢測分析各樣品中的目標物質，以監(jiān)控物品質量、檢測機體免疫機能和診斷某些疾病的體外檢測方法。免疫檢測是微量檢測方法，靈敏、特異。隨著方法和技術的改進，免疫檢測方法已滲入工、農(nóng)、食品、醫(yī)藥等各個領域。從20世紀50年代美國學者Berson和Yallow發(fā)明了放射免疫測定技術檢測胰島素起，免疫學檢測技術經(jīng)歷了從定性到定量；從常量分析到微量、超微量分析；從手工檢測到全自動化；從單個標本檢測到高通量檢測等一系列長足的進步。本章主要學習血清學檢測方法——抗原抗體檢測方法。年代學者貢獻1894J.Bordet補體與溶菌活性1896H.Durham,M.vonGruber特異凝集反應1896G.Widal,A.Sicad肥達試驗1897R.Kraus沉淀試驗1900J.Bordet,O.Gengou補體結合反應1900K.Landsteiner人類ABO血型及其抗體1906A.Wassermann梅毒補體結合反應1935M.Heidelberger,F.Kendall純化抗體,定量沉淀反應1941A.Coons免疫熒光標記1946J.Oudin凝膠內沉淀反應1948O.Ouchterlony,S.Elek雙擴散沉淀反應1953P.Grabar,C.Williams免疫電泳分析,Ig多樣性1960R.Yallow,S.Berson放射免疫標記1966S.Avrames,J.Uriel,etal酶標免疫技術1975G.Kohler,C.Milstein雜交瘤技術與單克隆抗體免疫學技術的發(fā)展史第一節(jié)免疫學檢測的基本原理抗原抗體反應指抗原與相應抗體間的特異性結合反應。曾叫血清學反應。

抗體結構CCFcFabNNNNCC一、抗原抗體的特異性結合抗原抗體的結合反應，在體內可介導溶細胞效應、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套機體體液免疫功能。體外反應有凝集作用、沉淀作用、調節(jié)作用、中和作用等。1、抗原抗體的互補性和親和性抗原抗體的結合是基于抗原決定簇（表位）與抗體超變區(qū)分子間的互補性和親和性?；パa性指抗原表位的空間結構與抗體分子超變區(qū)內的抗原結合位點間的空間結構互補嵌合。親和性指抗體分子上的抗原結合位點與相應抗原表位間互相適應產(chǎn)生的吸引力?；パa性是Ag和Ab結合的基礎，親和性是Ag和Ab間固有的作用力。2、抗原抗體結合力抗原和抗體分子的結合可以是游離形式的，也可以結合在細胞表面。這種結合也是非共價鍵結合?？乖c抗體相互結合只局限于分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結合位點之間，且以親和力的作用方式結合在一起。由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結果。這些吸引力只有在極短的距離內才有效。因此抗原決定簇與抗體結合位點在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結合力。這種分子間的互補結構決定了抗原抗體結合的專一性。抗原抗體間的作用力有：抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種：1、鹽鍵（離子鍵）2、范德華力3、疏水作用4、氫鍵3、親水膠轉化為疏水膠抗體和大部分抗原在溶液中是親水膠，不會聚沉。一旦破壞電荷和水化層，如Ag+Ab，減少電荷，由親水膠轉化為疏水膠，形成可見的Ag–Ab復合物沉淀。利用此沉淀反應可檢測相應的抗原或抗體。二、抗原抗體反應的特點1、特異性抗原與抗體相互結合必須有空間構型的互補性，因此，有很強的特異性。但，如果兩種抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗體間構型有部分或全部相同，就可能出現(xiàn)交叉結合——凝集或沉淀。既可能干擾實驗，也可以用于擴大應用范圍。2、比例性抗原（多價）抗體（2價或以上）不等價性，使抗原抗體反應時存在比例關系，生成物的量與反應物的量（濃度）有關。比例性：抗原抗體結合生成復合物的量與反應物濃度的關系。只有2者分子比例合適，結合價相互飽和，才生成可見的復合物。在等價帶區(qū)的溶液中幾乎不存在游歷的抗原和抗體。滴度（效價）指抗原或抗體與一定量的對應物產(chǎn)生明顯可見的反應所需的最小量?？乖`抗體稿反應點的等暴價帶也（zo胃ne策o余f杠eq糟ui燒va胳le震nc圾e）：曲線蘆的高裂峰部爬分，惑抗原床抗體桂分子縣比例很合適傘的范稼圍。在此唯范圍戀內，極抗原限抗體悉充分直結合銅，沉廟淀物茄形成鞋快而杯多。最適救比（op忘ti義ma則l垮ra占ti機o）：其中菊有一追管反阻應最本快，捐沉淀座物形辯成最碎多，撈上清字液中北幾乎購無游來離抗捉原或怕抗體么存在內，表回明抗懶原與偉抗體燈濃度勁的比認例最把為合昆適。帶現(xiàn)停象（zo匹ne較p趕he傷no巴me突no白n）：等價紛帶前榜后分隙別為園抗體含或抗航原過蜜剩則奪無沉閱淀物資形成。前帶登（pr孝ez吳on皇e）：抗體傅過量后帶符（po追st判zo扒ne）：抗原樂過剩?？乖目贵w乖比例炒對反革應現(xiàn)鑄象的逃影響3、可挑逆性抗原純抗體丟的結配合反炒應是支一個耍可逆意的反差應。Ag督+AbAg教-Ab高親遇和力使抗原濟表位炸和抗首體超燥變區(qū)遷的構聚型非襖常適漿合，子結合博牢固慮，不櫻易解晴離。開解離該取決些于：抗體晝對相在應抗齡原的短親和娘力環(huán)境付因素聾對復嫂合物鞠的影當響當抗齊體與番抗原賀結合咬時，宇如果礎是顆送?？褂鲈?，呼則出撕現(xiàn)凝冊集現(xiàn)證象；外如果謝是可替溶性串抗原滑，則盛產(chǎn)生吃沉淀脫作用吵。4、階度段性抗原袖抗體稿反應肅被人笨為分倒為2階段檢。結合饞階段蓬：當抗彎原與寬同型擔抗體霞相遇掛時，熔在合罵適條橫件下允，不行論彼摧此量擠的多僚少，烈都立短即發(fā)抹生特沃異性勝的結拔合形排成抗史原抗沖體復它合物楊，這極一過漂程通牲常只謙需要誦幾秒鄭的時準間便堡可完竿成，閣稱為紐奉反應足的一擦級階堪段。反應窗階段估：在一泡級階掏段之滾后，必繼發(fā)舟出現(xiàn)易抗原評與抗封體間帝進一佛步交株聯(lián)而運形成印網(wǎng)絡包狀凝域集物遞，進膊而出蟲現(xiàn)可陸見的替凝集炕和沉蛋淀，借稱為揭反應蹈的二培級階游段。儉這一駁階段雞是抗睛原抗駛體網(wǎng)勝格生魚長的火階段難，速鄙率要改慢的曠多，陜且在營很大燙程度合上依窯賴于欠溫度砍、離深子強伏度等堤外界掙條件斤，但祝更重慮要的困是需群要合煙適的世抗原百抗體考分子雖比例疤。只晴有當機二者壩的結備合價朱彼此輔飽和眼時，兇才能萬連接欺成一胸個大濾網(wǎng)格路樣凝厲集物混，出礎現(xiàn)凝楚集或售沉淀養(yǎng)。三、畜影響島抗原市抗體扔反應饑的因腫素抗原業(yè)抗體冬自身桌因素抗原毫：理如化性濱狀墻決定侄簇種德類和酸數(shù)量抗體抄：來源峰：惕兔等湊，良馬愚、人貴單克乒隆抗算體濃度特異以性和縣親和方力2環(huán)境盾因素電解蜓質Na+和C1－，可分姓別中勞和膠棒體粒祝子上出的電影荷，修使膠捕體粒偽子的身電勢恐下降詠，促套使抗劇原抗霉體復業(yè)合物往從溶稍液中純析出趣，形員成可毯見的胸沉淀漿物或鏟凝集象物。酸堿更度抗原最抗體匠反應裂一般票在pH為6～8進行葵。PH過高者或過期低都病將影揭響抗由原與仰抗體翅的理碗化性妨質，年例如pH達到洞或接僵近抗烈原的自等電平點時疲，即沿使無榮相應析抗體編存在憂，也邊會引鋸起顆胸粒性調抗原尚非特弄異性百的凝文集，惰造成輔假陽姓性反炮應。溫度溫度繩升高奴可加竹速分竹子運凡動，郊抗原章與抗虹體碰葬撞機犧會增右多，氣使反什應加怕速。勿但若騙溫度她高于56周℃時，巧可導開致已裁結合頭的抗怒原抗友體再魯解離奶，甚制至變笑性或補破壞佛；在40趕℃時，開結合剝速度爪慢，菊但結第合牢虜固，衰更易竟于觀抹察。演常用袖的抗售原抗童體反罰應溫淡度為37瓦℃。適當孟振蕩/攪拌可促漲進抗手原抗息體分疾子的找接觸情，加悼速反蛛應AbAg高親和力AbAg低親和力特異日性結合景力的抓表示映方法親和擇力和糧親合型力低親合力高親合力Ag嘩-Ab反應副的原淋理Ab過剩Ag過剩比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡Ag率-Ab反應節(jié)的可報見性常見亂血清萍學檢羞測1.凝集貓反應直接凝集反應1:刑2稀釋軟待測芽血清1:朗4鍬1滋:8井1勺:1傻6細菌到、細迷胞等茂顆粒雄性Ag或表少面包帽被抗瘦原的幟顆粒多狀物費質與什相應Ab在電販解質陳存在蘆的情餅況下匯結合顫，出珠現(xiàn)肉邪眼可嚼見的蓋凝集剛團現(xiàn)切象。玻片煌法試管挪法常用文于菌唐種鑒結定或AB廚O血型帽鑒定常用互于檢晝測抗蠻體的膽滴度斑或效趣價，桿見于繩臨床昏診斷街傷寒游或副柔傷寒次所用臘的肥晨達氏永反應洪和診漿斷布碼氏菌泰病所腸用的釘瑞特妹試驗產(chǎn)。間接烘凝集近反應將可黨溶性Ag場/Ab先吸絹附在毅某些獻顆粒衛(wèi)載體哥上，曲形成奮致敏免顆粒姜，然建后再害與相炕應Ab/A黃g進行阻反應腿產(chǎn)生睜凝集院，叫粱間接紋凝集撲反應累。如圈將溶龜血毒甲素O吸附余于乳漠膠顆蓄粒上點的抗補“O”試驗馳、人Ig論G作為Ag吸附樣于乳肝膠顆窄粒上見的類顫風濕艷因子淹檢測預。凝集旅反應匹常用姜于溶寸血性塔疾病傘的診罩斷：+YYYYYYYYYYYY病人送的RB輛C體內an烤ti貝-Rh由于澇抗體殲多屬度于Ig布G，分麥子量亂較小繁，抗陷體與魂紅細害胞間畝的結側合力筍不能派克服遺細胞懲間的忠排斥懲力，革不出武現(xiàn)凝住集+YYYYYYYYYYYYYYY體外紀加入托抗人Ig驗G出現(xiàn)毀凝集浸現(xiàn)象滿，叫直接刃庫姆誦試驗正常概人O型血護的Rh+的RB逮C+YYYY患者陸血清叉內的警游離an乓ti疾-Rh+Y體外忍加入池抗人Ig次GYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)國凝集徑現(xiàn)象乳，叫間接底庫姆盆試驗2.沉淀患反應AgAgAgAgAbingel單向侮免疫可擴散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向雜免疫凝擴散免疫身比濁過量AbAbAbAb毒素柏、組犧織浸剛液及張血清前中的祖蛋白蘋等可史溶性毯抗原粘與相挺應抗鎮(zhèn)體反摩應后爛，出查現(xiàn)肉終眼可碧見的畜沉淀貍物，畫稱為患沉淀致反應院。沉已淀反儉應可論在液潔體中多進行薦，也瘋可在草半固兵體瓊團脂凝典膠中閃進行幸。鑒定校多種荒抗原植是完裝全相蜻同、噴部分罩相同志或完盯全不鄰同用于神確定目抗原謀濃度沉淀房誠反應—免疫幕電泳存在腥于不眠同區(qū)透域的渠抗原類與抗榜體結幻玉合，禍在比屢例適苦宜處臉形成飾沉淀懶弧。扁沉淀青弧的搖數(shù)量綠、位坑置和貧形狀猴與標儉準品雹相對岸比，謝可分歇析樣偏品的恨成分耍及其蕩性質傲。第二昆節(jié)算免疫俯組織錄化學鉆檢測靠技術抗原您＋抗延體（飯?zhí)禺惏晷裕┓牛覆順擞洿贵w呈，通濱過酶歸與底愿物作并用生凈成有禿色反梳應物州，定火位組陰織或煌細胞吹內抗錄原的借一門丑技術換。免疫戚組織竹化學：用傅帶標年記物倦的抗僚體或惰抗原愛在組辮織細戒胞原屋位通雙過抗慈原抗屈體反級應或雙組織住化學吐反應廁，對軍相應騙抗或彎抗體傲進行泄定性歷、定潔量、被定位益測定角的技疑術。免疫返組化捧分類免疫攔組織贏化學年技術衣按照暮標記椒物的順種類匯可分盲為：免疫宋熒光羨法免疫芒酶法免疫運鐵蛋其白法免疫舒金法放射泊免疫石自顯堆影法按標掘記抗釀體的費方式許分：標記紗抗體IH賤CT法非標止記抗肆體IH的CT法非標紛記抗嫌體IH野CT法的浮二抗低不被妻標記誼，用該以免月疫動艷物制北備抗得酶抗瘦體，喬以酶-抗體據(jù)再與芒二抗攀結合嚴。按染壯色步促驟分奴：直接陵法（養(yǎng)一步卸法）間接貧法（2步法聲或多符步法年）一、享檢測炊原理通過差免疫儉學中體抗原有抗體吊結合看反應當，用騰特異班性抗累體(單克威隆或探多克果隆)或抗秀原檢秩測組缸織、車細胞損內相稈應的務抗原河或抗久體物越質，照形成含抗原-抗體友復合幅物；全利用仁此復察合物他上帶逗有預撞先標巾記的譽標記勢物，旱通過殺與標幻玉記物灶相對劉應的各檢測董系統(tǒng)挑，如早酶底痛物顯貼色反怎應可鉆使之釀呈現(xiàn)噸某種脆顏色榴，從挖而可那檢測割組織撒細胞拿內的磁抗原港，以鄰達到擁診斷椅、鑒必別診伍斷和債研究光的目綿的?？勺骺s慧為抗離原的蔬物質遷有酶、劈燕受厭體、御抗仍體、脈細本胞外積基質狠激素浙、溉細胞住結構例蛋白暮、病峽原體當。二、顧免疫遇標記羊物顯補色原喂理免疫鍬酶測唐定法免疫因熒光溉技術放射責免疫謹測定揭法免疫鴿膠體般金技犧術①免氣疫酶釘測定氏法夾心司法EL挽IS掌A間接EL澆IS戰(zhàn)ABA犧S—錘EL兇IS預A利用晃生物維素和兼抗生深物素賠蛋白目為橋穩(wěn)梁微粒剃捕獲脅酶免鳳疫分叢析技叉術將已惰知特矮異性冤抗體肚致敏棵的免剖疫微窄粒與糠生物惹素、鳥親和項素、曲酶相友結合紛，最尺后酶奧作用適于熒嬸光底吩物發(fā)幼光，咐通過寄檢測霜熒光障強度賠判斷邊未知教抗原抱的含職量。a）b）免疫滅組化誦技術定位細、定政性、者定量獨檢測②免躲疫熒啞光技狠術海馬春細胞微管輸?shù)鞍琢＞G色(胞體塔、樹悼突)軸突澡終末振蛋白啊紅色(突觸)培養(yǎng)趨的成寬纖維刷細胞微管昂呈綠裙色撐核呈徑藍色③放擺射免初疫測刪定用放窮射性擁核素伸標記容抗原土或抗參體進腥行的叼免疫呼測定然。將警同位思素的命敏感走性與拆抗原離抗體冒結合灶的特糾異性博結合膝起來鐮，具岔有重麗復性查好、忘準確訂性高忘等優(yōu)奮點，居廣泛放應用糕于激延素、錫藥物幅等微性量物蝕質的巷檢測已。常妄用的躺有13看1I、12績5I。④化高學發(fā)蔥光免醒疫技權術將化拿學發(fā)劇光分汽析和圈免疫逝反應根相結捎合而迫建立啊的一宇種新撒的免禿疫分慘析技隆術。池最常暑用的艘發(fā)光共物質累是魯嫁米諾含。靈敏鹽度高累、簡柳便、擦可實赤現(xiàn)自象動化旬分析內。⑤免絞疫膠疏體金暴技術用膠揮體金蛛顆粒泳標記Ab/A迅g，以糊檢測飾未知Ag匪/Ab的方兄法。氯金杠酸在脫還原擋劑作摧用下揉，可召聚合畏成特靜定大膚小的池金顆叫粒，且形成眼帶負竊電的嗽疏水騙膠溶懶液，雁因靜將電作望用而煉呈穩(wěn)史定的乳膠體鋸狀態(tài)宣。該技鼻術可西應用卡于免溫疫組?；?光鏡塔下檢痛查)和免柳疫層唱析快凱速診鉆斷。⑥免篩疫印牽跡法-W幫es饒te運rn勺b夢lo世tt激in屠g三、濟標記雁抗體激的特擁點與典應用脊原理1、一痰級抗敘體（木第一絹抗體恥）希屬識碎別系隱統(tǒng)，任特異療性識露別來珍自樣索本的擇靶抗饑原。常用鞭單抗魂或多汪抗，五實驗妄前-2較0濾℃—嫩-冤40翼℃保存越（1-潛2年有仗效）企，應精用液4℃約一毯周。援一抗歉的使窩用濃質度在回不同疑實驗統(tǒng)中是旺不一則樣的軋，最飄佳用傷量需拳經(jīng)預少實驗死確定蒸，一毅般選糾頂準獸陽性爬的稀腦釋度辰。2、二亂級抗棚體（快第二促抗體床）沃連接醒放大算和酶物標顯癥色指成示系螺統(tǒng)的紹抗體蠻。屬道橋連院抗體看，一鉗手連泊一抗跨，一科手連臂標志暢物（際酶）秀，根據(jù)佛一抗練的物蹈種來縣源選沫擇相逃應的寒抗該銷物種岔的二葛抗。如要瀉在實膜驗中陣同時填確定歇一抗堤、二夢抗的退濃度鄭，最趟簡單百的是雀方陣龍（棋含盤）偵滴定他法。3、非覺標志江抗體IH蠶CT和放車大檢喂測系登統(tǒng)的芬應用雕原理1）酶-抗酶持法（PA妨P）利用點酶聯(lián)洋抗體未將酶鴨與組臺織切敲片中搭抗原吵相結譯合，詞通過惕與適脊當?shù)准奈锓粗攽ò滞ǔＯ故荋2O2）以朗及二表氨基鞭聯(lián)苯楊胺(di混am蘆in冶ob準en凝zi躍di銅neDA畢B)的顯胖色劑右，產(chǎn)四生一捷種不優(yōu)溶性阻棕色谷反應若產(chǎn)物張。該兄法已宜被進區(qū)一步松改進判發(fā)展姿為更窯敏感掃的多愛級橋抬聯(lián)法量，后奶者利議于增醫(yī)加在蘋抗原指部位鏈反應將產(chǎn)物挨的沉曲積。PA換P法是挨酶-酶抗逢體(P挑AP因)復合陳物（著常用籠辣根醉過氧毀化物鄰酶）議組成資的可殖溶性導復合江物為勒五環(huán)巾狀結寬構，3個分凍子辣販根過巖氧化丸物酶凡和二特個抗妄體分姑子組掛成，鐘極為遇穩(wěn)定軋，比睬免疫味熒光吸法敏倡感10墻0-條10耍00倍，棵比酶譽橋法貸敏感20倍，浙其原汽理是提特異愚性初套級抗夫體（挨一抗勾）的Fa牙b段與染組織惱抗原蜓結合傳，二躺抗（予橋抗訓）在膝一抗華與PA犧P復合喇物之鉗間形醫(yī)成分溉子橋亮聯(lián)（違此時放一抗走與PA桿P中的副免疫箭球蛋護必須骨是同癥一種世屬，潛以使械得衍首生自看其它僚種屬嫂的二題抗，兇對一癢抗分粘子PA展P中的FC段及茄穩(wěn)定撒成份痰都具穗有特溉異性摘），狗洗滌卷后用H2O2和DA憲B顯色腸，陽駛性為環(huán)褐紅愉色，叼陰性茂無色勺。2）標訪記的肆親和滋素-生物貿素法歷（LS察AB）生物軟素是腿一種懸低分起子量悟的維生楚素，可黃以與棵抗體采（二于抗）鈔共價裙結合蚊。親迷合素燭是一儉種從發(fā)卵白醫(yī)素中籍提取否的具判有4個生就物素真結合擁位點粉的糖星蛋白廁，借撐生物腔素與蓮親和肺素的麥結合謝，將償抗體牙與酶券相連道，這佛一特具性能泥使之梨成為灣多級詢免疫莖酶學店系統(tǒng)例各成匪分之推間的坑橋接內物。19扮81年Hs浩u等人遍建立讀了抗體-生物慰素-親和州素-過氧接化物殖酶(Av持id錘iNBi盟ot歪iN債-p貧er齊ox摸id四as肥eCo平mp道le壘x洪AB暖C)系統(tǒng)。該紅方法黎是通蠢過生濾物素描相關瓦的次斑級抗殲體將遠一抗把連接央到親其和素-生物范素-過氧餐化物伸酶復慘合物作上。比PA單P法敏黨感8-藍40倍，塘特異我性強乏、非辜特異失性背虛景著盤色低愚、方遭法簡狹便、綱應用啦廣。AB俱C系統(tǒng)表通過價將鏈企球菌散抗生量物素綢蛋白慎代替東親和黃素蛋雹白而古得到寬進一轉步改辭進，援稱為鏈球隔菌抗燭生物脫素蛋保白-生物受素系深統(tǒng)(St錫re毛pt蜘av倡id點iNbi島ot柄iNsy媽st泉em某S芳AB希)。鏈球防菌抗倘生物勾素蛋刑白在蚊生理PH環(huán)境柜中為藝電中君性，傷而不沸產(chǎn)生證非特香異性久結合蠅，而確抗生扁物素捷蛋白花在生匙理PH環(huán)境距中帶納正電浪荷。明應用堅抗生傘物素克蛋白-生物局素法桐時，總內源喂性生魄物素娃能與性抗生杰物素伶蛋白-過氧刃化物雜酶復疲合物湯直接朗結合幻玉而產(chǎn)戶生非浪特異涼性或姑稱假胞陽性限染色罰，避少免的廉方法拼可先歸通過需切片峽與游抬離抗牲生物柏素蛋村白反朝應以造去除觸游離撲生物液素。葡萄叫球菌A蛋白(S回ta允ph藍yl錫oc炕oc贈ca盜lpr偽ot價ei好NA格SP萬A)是金世黃色鈴葡萄習球菌質細胞堅壁上疤的一練種蛋裂白成更分，單鏈止多肽魯，分階子量糧為42梨00漿0，SP匙A最大郊的特德點是牛能與匆不同晉種屬星血清巾中免娘疫球字蛋白棟分子芝穩(wěn)定FC段結姥合，丸此外揀還能誼與其蕉它物艘質如融熒光恢素、已過氧仙化物杜酶、濫鐵蛋莫白、嚴膠體腰金等爹結合巖，并說不影阻響其收生物適活性畝，因電此被椅用來倆發(fā)展祝為一粉種簡痰便而陰迅速喬的免降疫過驕氧化曲物酶餡法，扇即用SP叢A代替PA互P技術述中的檔次級丑抗體令，因SP桑A可與提多種解動物雕的抗悲血清陽反應寨，而珍不需斜因不鄉(xiāng)豐同種多動物錘而制慚備相農(nóng)應的拐第二縱抗體飄。SP役A可以選結合衡大多氧數(shù)Ig收G分子龜，可士以充率當?shù)谘菀豢够俭w和漫衍生難自不感同種軟屬的喜抗過直氧化永物酶學抗體友的橋炮接物冶即SP陡A-過氧京化物否酶聯(lián)犬法。市同時祥由于SP奴A與FC段的除高親旱和力表可以忠減少捏非特元異性葬背景削染色杯。3）多移聚螯藏合物宣法將抗該體和HR冷P共同穗連接觸在葡銀聚糖賤聚合搭物上蠢，形抖成抗透體—多聚五化合野物—酶。每靈敏賠度高調，每嘆個聚碑合物涉有超逃過20個點項與一櫻抗結蹤蝶合。4、現(xiàn)蓮色系楊統(tǒng)主要鄰有DA淋B，AE妨C（3-氨基-9徑-乙基訴卡巴滅唑(A批EC崗)）均索以HR文P為供留氫體余。固紅仁，固劣藍，予氯藍棄四唑扛（NB謀T），渠以堿暮性磷妥酸酶哄為現(xiàn)碧色劑濟。四、富基本旁操作她過程全過義程為粉：抗梁原制筐備與血純化非；抗烈體制商備；私標記于抗體郵制備咽；標固本采哥集與灑制備題；免殼疫組蕩化反魂應與粱現(xiàn)色刪；結扔果觀拜察與昆分析急。1、標殼本采冰集與毅制備石蠟劈燕切片宰細嶄胞爬降片冰凍直切片體細績胞涂而片組織茂印片石蠟催切片芒過程置：取張材—固定—沖洗—脫水—透明—浸蠟—包埋—切片—貼片—烤片—脫蠟—復水—染色—脫水—透明—封藏群等步盲驟。組織迷標本組織映標本冰凍織切片州操作歷方法姜及技亞術要我點：①取科材，此未能注固定第的組云織取連材，顆不能弊太大羅太厚怖，厚冬者冰寬凍費眨時，蘋大者潛難以拼切完即整，見最好容為24船×2擊4×次2m藝m。②取電出組刃織支泉承器飽，放蠟平擺饞好組適織，豪周邊兼滴上四包埋捧劑，府速放捎于冷棗凍臺倡上，懶冰凍內。小森組織月的應密先取竿一支家承器存，滴什上包乳埋劑好讓其筆冷凍催，形生成一母個小斜臺后吩，再閘放上否細小壁組織價，滴差上包誓埋劑搜。③將凡冷凍郵好的絞組織系塊，幻玉夾緊慎于切月片機臉持承季器上澇，啟交動粗勸進退傍鍵，伙轉動滴旋鈕妙，將慨組織都修平粒。④調雙好欲霜切的烤厚度滲，根螞據(jù)不怨同的房誠組織連而定炕，原財則上令是細包胞密狐集的寺薄切嗚，纖臨維多昌細胞勤稀的溪可稍綠為厚恥切，慶一般肆在5～10館um間。要注也意的鋤是：①組繡織快顯大小名合適②選膛擇合蜜適的癢冷凍于度答未固完定過母的組苗織-1模0—測-1帖5℃，脾、劣腎、浴肌肉嗓等-1蟲5—哀-2談0℃，含柿脂肪序組織-2鋸5—川-3奸0℃。③及爬時清磁除殘思余的蘇包埋現(xiàn)劑，孫防止曉撕裂侄組織抱。④組稈織塊伶無須辭固定⑤用扎于附壤貼切俗片的紹載玻帝片室慶溫存擺放，拴無須獻冷凍勝。⑥切到片不皇能馬偶上染匙色的挖可晾解干低寬溫冷悄藏，濫或置洽組織黑培養(yǎng)饒液內傲。0-椅4繩℃保存唉。2、免曾疫化感學染錫色酶法也染色免疫風熒光旅染色追標稍本處滑理—熒光殿試劑—封片宗觀察一般勸為冰眉凍切撤片，倚石蠟鐵切片著效果盛差。免疫魂膠體考金染話色免疫菌金銀伏染色免疫環(huán)雙重/多重塘標記院染色島同一愛切片情的同障一組帝織上滲同時紡顯示2種/以上短的抗口原成搬分，灰也稱永免疫端組化胖雙染教法。征要求2種抗貼原分頁布于厚細胞箱不同凈部位瓣。針勻對抗蔥原使互用不餃同顏懇色的析熒光攔素、償酶或傻不同裙直徑恢的顆虜粒。五、撒免疫對組化律的影殊響因柄素與膠對策1、非接特異師性著擠色由內市源性易酶和旗生物芹素干怒擾余滅活營酶，厚用親沒和素賀飽和到生物危素。電荷兵吸附BS蹦A或二染抗動興物血待清封津閉非棵特異喪位點奴?？贵w錦原因抗體畏不純振或標舌本含聾與靶界抗原出類似唱的表墻位。巡壽用單骨抗。洗滌賺不充眼分加去聯(lián)污劑弟等洗恨。DA守B不溶能性顆代粒未打除掉序而沉蔥積在衛(wèi)組織瓶上。制片她不當賴壞死外、變鋪性、銹炎癥孕組織販、切睜片拱錘起、塘皺縮血、邊鉛沿缺帶損等想。二?？箘芋w物血著清封紛閉或誰重切帥。2、組創(chuàng)化染待色的衛(wèi)假陰盜性標本雖保存啞不當晨老舊劃標本跟、固脂定不便當或畝固定或時間鵲太長稀、溫潛度過煎高等細，改鄉(xiāng)豐善條公件，畜重做遠?？贵w鳥等試津劑質昨量差母滴度倍、純碼度、榆特異癥性或妥保存翁不當瓦，更同換新將試劑谷再做燭。操作側失誤盾嚴格遙按操夜作規(guī)爺程作中。3、雜凡音免疫撇組化膊中的茂非正患常的平背景更著色卵。常見云于抗積體濃演度過帥高、掀切片艦粘貼書不牢洪，邊姥沿松肌動等第三休節(jié)配免疫棟印跡損技術19攪79年Re醒na唉rtan新dTo曠wb呼in將So芝ut尖he拍rn旅b扣lo朋tt紫in心g技術表應用趴與蛋券白質申研究冰，并娃與酶貴免疫挽技術役結合虹建立鴨的蛋鐮白檢編測技泛術。靈敏耕度高翠，1-碎5ng。簡輔單、鎮(zhèn)快速民、經(jīng)簡濟。目前拼，廣廚泛用疏于蛋柏白質責相互到作用恭研究脹和抗孕原性菌研究順。一、今原理加：蛋白光質組隔分經(jīng)SD竭S-衛(wèi)PA獄GE分離暮后，荒平行往轉移仇到固籃相支歲持體勸（NC膜或PV逝DF膜）豎上，勝通過疲免疫旱試劑濤來檢污測靶戚蛋白熔。浸泡塔式電等轉移源的條對件溫編和，綢對蛋拴白樣傲本損僚失較魂小，缺點餐是耗含時長隸，需艱大量辛緩沖鍵液；例半干踐式電番轉移解時間短，尊但有輛可能烈損傷盛樣品膨。今瞞天采橋取浸藝泡式紛電轉蟻移。靶蛋衡白的康檢測凳通常悶采用筆兩步翼法或諷間接豬法，榆用一糖抗結合靶油蛋白院，再濱用過叨氧化御物酶茄（HR蔑P）標記賠的二盜抗結合率一抗舒，然糊后HR聲P催化秤化學鳥顯色耗反應注或化惕學發(fā)光反腫應。調當前悲多采歷取化忠學顯油色反攪應。免疫戶學檢起測封閉加一計抗網(wǎng)洗膜加二限抗洗膜加底印物試驗耀記錄搖育撫過夜搖育解2h（3旋次，掉每次子10mi遇n嬸）搖育沒1h二、亭操作陶過程1.斥S勵DS糊-P香AG池E電泳2.電轉彼移：將冷脈卻管怕接上燈水龍銳頭，販接上拒電源湯，根旨據(jù)凝宿膠面免積調抗節(jié)電命流（0.弦65丑mA蚊/c筒m2），時間2小時蹄。3.電轉敞移結舞束后池，打嚴開夾的板，榆剪下NC膜左址右上殺角做洋標記誘（即券標記本有蛋澇白結胸合面豎）。滔然后農(nóng)把NC膜分厭為兩帳份，鏟其中叉一份萄放入童氨基砍黑染擱色液卸中染是色30～60秒，10％乙滑酸漂燥洗，門觀察滴膜上嗓有無顏蛋白芳條帶徑。如果撓有，莫可用凝另一誼份繼索續(xù)以貪下的川實驗礙。4.封閉季：（將NC膜上拜無蛋鋤白結坊合處腎封閉哥，防拿止探營針的晌非特凱異性業(yè)結合憶）在競一培被養(yǎng)皿澇內倒撥入封冷閉液春（5％脫般脂奶克粉）作，將囑未染鏟色的NC膜放槽入浸剛泡，用室溫區(qū)放置1小時灑。5.探針壓結合昨：封奪閉結村束后宇，用PB脈S漂洗嬌一次狠。倒疲干PB脊S后，屢加入HR辜P標記貍羊抗稿鼠Ig驕G稀釋渡液，37oC孵育1小時捏。6.孵育移完成垂后，PB堵S漂洗介三次掃（每來次浸樸泡3分鐘蜻），侵將未腫結合營探針燙盡可雨能洗賞掉。延倒干PB克S后，圓加入貞底物然工作任液，貨避光爪顯色10分鐘蔬，觀讀察顏阻色變醫(yī)化。三、肢影響膝因素岔與對紅策1、影賣響SD茫S-導PA便GE的因接素2、影息響蛋旨白轉抵移的繭因素幕轉移仗膜的姨活化行與大綠小、語緩沖邪液、別是否櫻平整有、有包無氣應泡、熄電壓拋、溫爺度、棄轉移嶼時間錢等。3、封躁閉窮封墓閉試排劑濃鍛度不枯能過狐高過冒低。4、顯駁色譯設棍立陰限陽性賭對照裂，DA稍B顯色仁后立四即照扒相，喊否則朗易腿候色。酶免義疫技燭術按舊目的分類（一協(xié)）酶養(yǎng)免疫劣組織返化學闊測定久技術（二拔）酶暢免疫棚測定到技術Ab*＋Ag暢→Ab*A洋g＋Ab*Ab＋Ag相*狀→Ab族Ag*＋Ag若*（1）Ho肅mo敲ge畜no晝us（均殺相測談定）（2）He國te幣ro舌ge氏no亭us（異涂相測鏟定）——旬S想ol堆id要p耳ha錘se——謝li麻qu滿id恭p腳ha秩se第四會節(jié)酸酶聯(lián)拌免疫復檢測血技術一、EL毫IS捎A的基取本原繪理EL疤IS藥A(臂En森zy和me-L身in呈ke得dim姨mu揭no天so虹rb很en舊tas柳sa果y)的基攝礎是免抗原豈或抗果體的授固相糾化及晝抗原蕉或抗比體的厭酶標鴨記。灶這一付方法孩的基屋本原銀理如往下。（1）使獸抗原真或抗績體結狼合到淡某種壁固相侄載體柴表面洋，并源保持藍其免煌疫活躁性；（2）使續(xù)抗原留或抗基體與政某種昨酶連拒接成危酶標惱抗原落或抗威體，傻這種就酶標秩抗原浴或抗嘴體既擴保留組其免蛾疫活許性．敘又保萄留酶造的活墊性。二、則基本守操作索流程測定橡抗原僚常用席雙抗引體夾冶心法未，測頭定抗尚體用狂間接哭法。基本截過程為：固相馬包被驗（吸卵附已如知成播分、疼洗滌嚇、封鑼閉、偵洗滌鑼）加待飛測樣糾品妥促反穩(wěn)應內洗濫滌僑加酶腎結合狼物促反蓄應廢洗屆滌狹加瓣酶底姓物宮促反國應替終蘭止反逗應測定思（比偉色、躍熒光饒）EL幅IS奪A的類善型：EL鋪IS艦A可用斧于測料定抗訊原，識也可毒用于兼測定換抗體肯。用預于這撤些目舍的的粥檢測線方法宇主要森有以叛下幾搬種類夏型。1雙抗尖體(原)夾心兩法2間接筑法3競爭豈法4雙位扭點一斷步法5捕獲棗法測Ig激M抗體6應用杠親和慮素和勉生物煎素的EL傻IS世AEL惹IS奶A的類利型EL攀IS然A可用苗于測弊定抗曠原，選也可獄用于巨測定授抗體來。在位這種死測定等方法拘中有煉三個辭必要銅的試槍劑：（1）固拉相的驚抗原略或抗據(jù)體，毯即"免疫石吸附灰劑"（im緊mu刻no世so莖rb販en覆t）；（2）酶標付記的惡抗原噸或抗瘦體，沫稱為"結合循物"（co體nj殼ug依at臘e）；（3）酶反叮應的遣底物喚?？稍O貞計出辭各種榴不同悠類型匪的檢衡測方圾法。1、夾筒心法過程旁：包伐被勉加待廢測樣虜品喬洗之滌騎加酶插標記饑物批洗滌加底美物雖測定1）雙敲抗體柄夾心覺法測穗抗原此法擠適用異于檢濃驗各拴種蛋困白質手等大塊分子債抗原鬧（二洋價及噸以上押），羊例如HB售sA差g、HB屋eA駱g、AF怨P等。晴只要宇獲得堆針對耀受檢佳抗原厘的異蓄性抗蠻體，仇就可嘴用于博包被歉固相匠載體裙和制負備酶借結合滲物而切建立儉此法拴。2）雙販抗原昂夾心滴法測皇抗體用特姓異性變抗原趴進行貪包被獸和制腹備酶架結合湖物。恭此法掙中受鋼檢標漿本不轎需稀拾釋，廢可直奏接用胞于測籃定，抄因此崗其敏牲感度轎相對個高于嶄間接濤法。茂乙肝特標志對物中宣抗HB占sA耍g的檢測該常采邪用本夾法。論本法腳關鍵屈在于冰酶標單抗原迫的制付備，因應根捏據(jù)抗頭原結荷構的聾不同膚，尋內找合乖適的野標記絡方法咬。2、間濫接法堡測抗忌體1）間融接測河抗體地法傳染杯病的懶診斷惑。間悟接法付的優(yōu)縣點是外只要還變換陽包被赤抗原球就可受利用累同一臟酶標淹抗抗兵體建摧立檢神測相仙應抗征體的彈方法悄。2）間侍接測酷抗原霧法3、雙傅位點物一步代法測定近抗原由雙沾抗體杠夾心碗改進唱而來拉，將逃雙抗凳體夾順心中吧針對寸同一羨抗原貌決定昨簇的2種抗誓體改昆為針柳對抗豆原不看同決茅定簇疑的2種單輩抗。評敏感灶性和費特異棒性大趟為提濫高。但抗軟原過陳量，Ag分別命與固爭相抗鐘體和肝酶標霧抗體蝦結合款，抑昂制夾比心復倦合物色形成材，出章現(xiàn)所控謂鉤蜜狀效討應，惰甚至制假陰設性結性果。過程手：Ab柿1包被苗加待鍵測樣偶品和尊酶標Ab器2洗滌披底愚物也可籍用雙寨抗原絡夾心蔽測抗邁體4、競彎爭法貢測抗挎體過程忍：將集待測支抗體厭（原居）同投時加謝入包燃被孔爺，洗稻滌除校去酶漁標記直物，賤加底瞧物測鄭定。用于絲式測定且只有怪一個惜決定意簇的秘小分墾子抗得原或池半抗扇原，作當抗祥原材岸料中麥的干藏擾物雀質不妄易除沈去，防或不乎易得知到足售夠的模純化韻抗原穗時，史可用錘此法柜檢測杠特異墻性抗慨體。競爭犧法測料抗原小分茅子抗頁原或路半抗販原缺皂乏可跌作夾緒心法銹的兩起個以崗上的位點，因趟此不箏能用賓雙抗傅體夾慣心法戒進行崖測定剛，可轉以采疏用競捕爭法閑模式鉤。其炮原理患是標滲本中地的抗金原和配一定址量的摸酶標逃抗原淡競爭嗚與固謎相抗胳體結立合。棚標本拆中抗撐原量朽含量辯愈多我，結中合在妙固相召上的婚酶標兩抗原省愈少吵，最瘡后的傍顯色吧也愈溪淺。位小分曲子激赤素、待藥物斧等EL椒IS妨A測定孟多用帶此法距。競爭EL坦IS倡A檢測焦抗蜻原5、