第三章固定化酶

第三章

酶的固定化第一節(jié)酶的固定化第二節(jié)輔酶的固定方法第三節(jié)固定化細(xì)胞第四節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第五節(jié)固定化酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)對(duì)于現(xiàn)代工業(yè)來說，酶不是一種理想的催化劑絕大多數(shù)水溶性的酶，酶蛋白對(duì)外界環(huán)境很敏感，極易失活。催化結(jié)束后極難回收，只能進(jìn)行分批生產(chǎn)。解決辦法??第一節(jié)酶的固定化一、固定化酶（ImmobilizedEnzyme）定義：是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可回收重復(fù)使用。固定化酶優(yōu)點(diǎn)：

(1)簡化了提純工藝(2)可以裝塔連續(xù)反應(yīng)(3)有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化

(4)多次使用

(5)較游離酶相比能適應(yīng)于多酶反應(yīng)(6)產(chǎn)品質(zhì)量高，成本低

固定化酶缺點(diǎn)：①酶活力有損失②工廠初始投資大③只能用于可溶性底物，對(duì)大分子底物不適宜④與完整菌體相比，需要輔助因子的催化反應(yīng)不適宜于多酶反應(yīng)固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)固定化酶的制備原則①必須注意維持酶的催化活性及專一性。②固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度有利于生產(chǎn)自動(dòng)化，連續(xù)化，不能因機(jī)械攪拌而破碎或脫落。③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻

盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。

④酶與載體必須結(jié)合牢固

能回收貯藏，反復(fù)使用。⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性

所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。固定化酶的制備原則⑥固定化酶應(yīng)容易與產(chǎn)物分離，即能通過簡單的過濾或離心就可回收和重復(fù)使用。⑦固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。⑧充分考慮到固定化酶制備過程和應(yīng)用過程中的安全因素。固定化載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的形式載體的結(jié)構(gòu)載體的性質(zhì)酶偶聯(lián)量或裝載量和實(shí)效系數(shù)二、固定化酶的制備方法

結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法微囊法網(wǎng)格法包埋法化學(xué)結(jié)合法交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法非化學(xué)結(jié)合法1、物理吸附法

(physicaladsorption)是通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于不溶性載體的方法。選擇載體的原則

①要有巨大的比表面積

②要有活潑的表面

③便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。常用的載體有：(1)有機(jī)載體：纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等。(2)無機(jī)載體：氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。無機(jī)載體的吸附容量較低，而且酶容易脫落。2、離子結(jié)合法

(在工業(yè)上具廣泛的用途)將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基團(tuán)間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。⑴陰離子交換劑：

二乙基氨基乙基(DEAE)—纖維素、混合胺類(ECTEDLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、410、900等。⑵陽離子交換劑：

羧甲基(CM)—纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG50、IRC—50、IR—200、Dowex-50等。

1969年，最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化氨基?；妇褪鞘褂枚嗵穷愱庪x子交換劑DEAE-SephadexA-25固定化的。吸附法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時(shí)達(dá)到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破壞和酶高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，酶活力損失很少。缺點(diǎn)：

酶與載體相互作用力弱導(dǎo)致酶易脫落。吸附程度的影響因素:1.pH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附2.離子強(qiáng)度：一般認(rèn)為鹽阻止吸附。3.蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4.溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。5.吸附速度：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。

6.載體：非多孔性載體---顆粒越小吸附力越強(qiáng)。多孔性載體--要考慮酶的大小和吸附面積的大小。3、包濾埋法包埋踩法是將憐酶物謝理包織埋在臭高聚悟物網(wǎng)飾格內(nèi)牢的固絞定化瓶方法衣。如將翁聚合解物的淘單體損和酶計(jì)溶液渾混合況后，嫂再借慎助聚淘合促圍進(jìn)劑銀的作鏡用進(jìn)順行聚蘇合，舒將酶續(xù)包埋聽于聚祥合物齡中以運(yùn)達(dá)到耕固定煌化的幕目的丹。包括烈凝膠咽包埋翠和微用囊化胖包埋輛兩種朝。(1宏)凝膠遵包埋枕法：將酶豈分子雁包埋翅在凝堤膠高驗(yàn)聚物盒網(wǎng)格繪內(nèi)的牌包埋妄方法總。聚丙值烯酰賄胺、海藻探酸鈉、K-角叉波菜膠儲(chǔ)（卡床拉膠耗）、膠原主和明榆膠等先把終丙烯撇酰胺而單體沸、交各聯(lián)劑益（如N,席N-甲叉省雙丙宋烯酰狡胺）池和懸搞浮在慕緩沖引溶液共中的城酶混紗合，溝然后刺加入蛾聚合始催化叼劑（獎(jiǎng)如二刃甲氨掙基丙嚷腈與終過硫川酸鉀猴）使愛之開勇始聚頌合，搖結(jié)果宋就在朵酶分藝子周拘圍形貨成交餃聯(lián)的杜高聚乓物網(wǎng)演絡(luò)。特點(diǎn):它的焦機(jī)械趨強(qiáng)度保高，蒙在包埋宿的同鹿時(shí)使課酶共滔價(jià)偶名聯(lián)到蛙高聚妥物上。缺點(diǎn)餅：酶滲容易猾漏失厭，以過低分獅子量揭蛋白爛質(zhì)為押甚。減調(diào)整攪交聯(lián)廚劑濃刮度與嘆交聯(lián)沙程度雄可以潮得到轉(zhuǎn)克服慎。聚丙洽烯酰融胺包埋海藻暗酸鈉它從榜海藻圈中提推取出廚來，套可被氏多價(jià)塔離子Ca2+、Al3+凝膠蝴化姓，操世作簡陣單經(jīng)背濟(jì)。K-角叉跳萊膠喂（卡設(shè)拉膠班）卡拉德膠(K仇-Ca付rr餡ag艇ee抽ni讀n)是由順角叉揪菜(又稱歌鹿角坦菜；Ca制wa創(chuàng)ge落en)中提鹿取的債一種微多糖巡壽?？梢詡?cè)冷卻哄成膠淋或與抓二、額三價(jià)勉金屬籮離子楚成膠扁。包蚊埋條料件溫冒和無窮毒性豬，機(jī)身械強(qiáng)顫度好拾。固召定化獅的酶班活回沉收率方和穩(wěn)拒定性滋都比拒聚丙煩烯酰枝胺法器好。(2談)微囊蜜化包偽埋法微囊變法主要戴將酶嫂封裝危在半斜透性感聚合灣物膜肥的微航囊中坐（如景膠囊哄、脂影質(zhì)體意和中聰空纖厚維）天。膠囊慕和脂庸質(zhì)體戶主要夫用于蜜醫(yī)學(xué)欄治療；中空沒纖維雖主要季適于牙工業(yè)趙使用金。主要毫包括（1）界姑面沉籠淀法（2）界射面聚棍合法（3）脂句質(zhì)體債包埋緊法界面墳沉淀遭法物理粥微囊已化法。忽它是般利用某些但高聚類物在刮水相爬和有壁機(jī)相腎的界尤面上疾溶解跌度較完低而京形成房誠的皮拜膜將修酶包嗓埋。此法希條件雅溫和臨，酶瓦失活賠少，怖但要羨完全薦除去闖膜上搭殘留灑的有滔機(jī)溶權(quán)劑很斧麻煩餅。作創(chuàng)為膜么材料此的高對(duì)聚物裙有硝炸酸纖駕維素辛、聚禮苯乙標(biāo)烯和寺聚甲凍基丙俊烯酸綿甲酯右等。界面耗聚合薦法化學(xué)方法撿。將疏荒水性靈和親孤水性燈單體哭在界傻面進(jìn)皺行聚欲合，前形成烘半透貸膜，急將酶幸包埋除于半瓣透膜惜微囊剝中。所得每的微腐囊外巷觀好悠，但莫不穩(wěn)紀(jì)定，霉有些并酶還倍會(huì)因鎖在包駱埋過擴(kuò)程中湊發(fā)生默化學(xué)唯反應(yīng)氧而失姐活。此法寺制備萄的微素囊大憂小能滴隨乳菜化劑夠濃度劣和乳軋化時(shí)糞的攪陪拌速涉度而勤自由發(fā)控制告，制兆備過灶程所柱需時(shí)鋒間非夜常短植。脂質(zhì)控體包換埋法慢：由表雙面活漏性劑變和卵衛(wèi)磷脂辛等形風(fēng)成液評(píng)膜包池埋酶其特小征是遍底物漢或產(chǎn)寸物的治膜透傭過性淺不依味輔于為膜孔凱徑大帝小，獸而只梢依賴環(huán)于對(duì)貿(mào)膜成變分的昏溶解竹度，撇因此步可加刪快底徹物透歌過膜競的速掉度。包埋掃法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)沿條件席溫和安、很拜少改第變酶裳結(jié)構(gòu)緊但是巧又較片牢固圣。缺點(diǎn):只有轎小分使子底秧物和費(fèi)產(chǎn)物扛可以復(fù)通過中高聚秘物網(wǎng)滾架擴(kuò)秧散，笨對(duì)那吊些底言物和盒產(chǎn)物殺是大川分子葬的酶厚并不久適合怪。(適用犁于脲睜酶、與天冬值酰胺名酶、掃過氧妥化氫霸酶的油固定應(yīng)化)原因譯：高肉聚物標(biāo)網(wǎng)架萍會(huì)對(duì)袋大分品子物輩質(zhì)產(chǎn)指生擴(kuò)附散阻亂力導(dǎo)遣致固煌定化炒酶動(dòng)乳力學(xué)悟行為飛改變綢，使恢活力恒降低拒。查資抵料自落學(xué)溶膠——凝膠鄙包埋意法前驅(qū)糖體（蓬烷氧豆基硅質(zhì)烷及翠其衍杜生物眉，如TM討OS和TE讀OS），屬在液御相下扇將酶索、硅苗源等鋒均勻悲混合醒，經(jīng)耗水解頂、縮怪合反顏應(yīng)，虹溶液叨形成趕穩(wěn)定村透明嗽的溶冒膠體雄系，奶溶膠腰進(jìn)一產(chǎn)步陳影化，桃膠粒斧間緩竄慢聚旁合而持形成鼠三維稿空間礙網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)結(jié)構(gòu)占的凝儀膠，次在此休過程城中凝捏膠圍沖繞酶你分子苗而將怨其包她埋，醋網(wǎng)絡(luò)險(xiǎn)間充培滿了聲受束固縛的印溶劑折，將型溶劑城進(jìn)行鬧蒸發(fā)層、超箭臨界袖等處樓理后叮，即巡壽獲得拜固定后化酶味。4、化伸學(xué)結(jié)竊合法猾－共駛價(jià)結(jié)合法原理:酶蛋比白分搖子上孝的功能靜基團(tuán)（酶的非活薯性必痕需側(cè)塊鏈基鄙團(tuán)）和固倉相支筆持物競表面辭上的反應(yīng)溝基團(tuán)之間攻形成歸共價(jià)深鍵，追因而騙將酶竄固定滾在支呢持物辣上。最常塵用的酬偶聯(lián)乒基團(tuán)炒：-N愿H2、CO顯OH、-S尚H、-O脾H、酚基做、咪公唑基兩種碗固定獨(dú)方式將載姐體有黃關(guān)基堅(jiān)團(tuán)季活化策，然晴后此煤活潑閃基團(tuán)鴉再與置酶分珍子上伸某一崖基團(tuán)款反應(yīng)鴨形成驅(qū)共價(jià)脖鍵。在載胳體上命接上贏一個(gè)螺雙功濟(jì)能試饑劑，使然后瀉將酶仗偶聯(lián)胞上去歲。（4）載旨體活潔化的餅方法A．重氮機(jī)法B．疊氮元法C．烷基約化反帽應(yīng)法D．硅烷倡化法E．溴化仁氰法A．重氮色法反應(yīng)慌示意賞式如獲下A．重氮鳳法目前封在我燒們國攏內(nèi)用點(diǎn)的較檢多的抄載體斧是對(duì)更氨基招苯磺躬酰乙己基（AB敞SE）纖維些素、淡瓊脂嘴糖，恰葡聚健糖凝見膠和搶瓊脂緊等該方幕法需魚要載臟體具專有芳估香族筒氨基A．重氮延法反應(yīng)壇式及牛原理B疊氮甜法例用羧勿甲基兵纖維凈素疊森氮衍姻生物猶制備穩(wěn)固定電化胰摘蛋白下酶，脫步驟廁如下妙：⑴酯化⑵肼解⑶疊氮似化(4暗)偶聯(lián)B疊氮本法對(duì)含心有羧惹基的連載體疼，與剝肼基密作用耕生成缺含有怖酰肼硬基團(tuán)插的載話體，款再與否亞硝聚酸活決化，答生成鞋疊氮留化合嚴(yán)物。劃最后保與酶戲偶聯(lián)C．烷基爐化反寒應(yīng)法含羥勝基的熄載體滋可用自三氯典三嗪裳等多暴鹵代薦物進(jìn)學(xué)行活眼化，旨形成黨含有娘鹵素礎(chǔ)基團(tuán)臟的活失化載堅(jiān)體。D．溴輩化氰春法本方濫法主蜜要用鬧溴化衫氰（CN島Br）活化水多糖怪類物盼質(zhì)。驢如纖戴維素缺、葡米聚糖蠻、瓊掏脂糖鞏等，酷其中配以瓊做脂糖劑為載抖體的把占多煌數(shù)（瞧大孔緣瑞網(wǎng)狀惜結(jié)構(gòu)鋼）。西用溴煙化氰帥法活躍化瓊蜂脂糖其制備洞得到艦的固氧定化疾酶目督前使叫用很帳廣，凳特別強(qiáng)用作究親和果層析御，有嘴著良斑好的鋤性能刺。E．溴化膜氰法共價(jià)結(jié)合法中東的影姜響因糞素1.要求載體猾親水，并伏且有患一定蠟的機(jī)夏械強(qiáng)奏度和施穩(wěn)定胳性，鐵同時(shí)堵具備迎在溫點(diǎn)和條庸件下雹與酶禾結(jié)合氏的功揀能基缸團(tuán)。2.偶聯(lián)注反應(yīng)逗的反應(yīng)罩條件必須忘在溫和pH、中等邀離子泡強(qiáng)度者和低識(shí)溫的賞緩沖守溶液亞中。3.所選擴(kuò)擇的干偶聯(lián)洋反應(yīng)慎要盡循量考值慮到旗對(duì)酶散的其舉它功飄能基煎團(tuán)副反插應(yīng)盡萌可能貢少。4.要考居慮到酶固返定化勾后的劫構(gòu)型，盡籠量減絕少載識(shí)體的喉空間魯位阻敲對(duì)酶扁活力撒的影慘響。共價(jià)結(jié)合法的瘦特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：固定棚化酶摧結(jié)合梯牢固穩(wěn)定冷性好利于怠連續(xù)坑使用是目嘆前應(yīng)壞用和理報(bào)道庫最多灑的一參類方渾法。缺點(diǎn):載體筍活化翻的操作共復(fù)雜綁，反匙應(yīng)條濁件激鋪烈，需傳要嚴(yán)兄格控助制條棕件才盲可以宜獲得手較高霸活力聾的固貫定化系酶。會(huì)影響怨酶的波空間引構(gòu)象，從坊而影死響酶科的催唇化活冷性,活力承回收悶率一池般較殿低。4、化學(xué)縱結(jié)合碗法－交聯(lián)濟(jì)法利用渾雙功強(qiáng)能或斬多功守能試助劑在酶分伯子間惡、酶研分子炎與惰管性蛋屢白間掙或酶乓分子峰與載獄體間進(jìn)行交聯(lián)反魔應(yīng)，辣把酶雁蛋白誘分子燥彼此仔交叉勒連接獸起來預(yù)，形川成網(wǎng)市絡(luò)結(jié)扛構(gòu)的謀固定許化酶秘。目前場常用裁的交葬聯(lián)試遣劑是戊二蘇醛。戊二添醛[O衰HC爐-(貫CH2)3-C灰HO映]有兩慌個(gè)醛稅基，廉可與E-斤NH2生成Sh識(shí)if衰f’揉s堿而價(jià)使酶斑蛋白萄間交脖聯(lián)，散制成醫(yī)固定娘化酶志，交諷聯(lián)時(shí)姥的pH通常濕與酶隙的pI相同腰。交聯(lián)蕉法常值與吸踐附法雖結(jié)合濃使用刊，或奸者與割包埋洗法配償合，賀目的醋是使蹲酶緊唇緊地菌結(jié)合暗于載糕體上納。酶直戀接交畫聯(lián)法在酶為液中茶加入散適量昂多功添能試傅劑，雹使其鞋形成稱不溶廟性衍激生物副。固定姓化依仁賴于雪酶與怒試劑膨的濃遙度、施溶液pH和離該子強(qiáng)普度、犯溫度色和反熱應(yīng)時(shí)獵間之歲間的愛平衡汽。例：嚇木瓜瞎蛋白捆酶在0.也2％酶固蛋白降濃度松、2.左3％戊圈二醛政、pH借5.懇2-骨7.互2、0℃下交假聯(lián)24思h，可形散成固雁定化呆酶。固定縣化酶軌制備瞞方法模比較物理吸附離子結(jié)合包埋法交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法制備易易難難結(jié)合力弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中底物專一性無變化無變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低中中高制法特性定向博固定舒化由于氧酶蛋隨白多喊點(diǎn)附弟著在感載體嘉上，黑引起余了固地定化匙酶蛋絮白無捆序的懷定向辛和結(jié)遙構(gòu)變嫌形的懸增加悉。定向任固定典化技摔術(shù)的作優(yōu)點(diǎn)橡：(1譜)每一杰個(gè)酶仔蛋白濫分子翼通過腦其一蹈個(gè)特眠定的拳位點(diǎn)核以可蟲重復(fù)去的方內(nèi)式進(jìn)向行固零定化;(2飄)有利柏于進(jìn)雄一步籮研究粥蛋白醒質(zhì)結(jié)愚構(gòu);(3省)可以克借助凳一個(gè)論與酶忍蛋白適的酶僑活性崗無關(guān)僑或影肆響很運(yùn)小的孔氨基偏酸來秧實(shí)現(xiàn)衛(wèi)。定向唉固定否化方環(huán)法酶和搜抗體叨的親谷和連賊接酶通滴過糖端基部常分固糧定化酶和愛金屬儉離子案連接分子拾生物悅學(xué)方宏法破基片因融計(jì)合法翻譯叉后修楊飾法特定恰位點(diǎn)枝基因鑼突變狠法第二孟節(jié)限輔份酶的譯固定常方法原因約1／3的酶厘的催榴化作補(bǔ)用得牧以進(jìn)擇行需廣要輔澡酶的限參與肅，缺控少它謀們，舉酶就嗚不能毒表達(dá)例其活賠性惜。在工炊業(yè)上記應(yīng)用定全酶階的關(guān)穩(wěn)鍵是育有機(jī)嗓輔因滋子的猶保留券和再江生，研因?yàn)闈u在反阻應(yīng)之仔后，役大多預(yù)數(shù)有芳機(jī)輔封因子港不能定自行丙再生島，其多結(jié)構(gòu)扒往往笛發(fā)生藥改變炸。有機(jī)律輔因養(yǎng)子價(jià)棟格昂叢貴輔基——容易抵回收與酶宇蛋白濱結(jié)合理比較遼牢固鬼，通溜?？删S以用峰超濾資膜截吵留等惠物理臨方法寧進(jìn)行山回收青。輔酶——回收吸再生辭困難輔酶岡分子缸量小膜，難涼以截足留再森生。將其屈與水妥溶性估大分架子載鑼體或之水不睜溶性登載體偏結(jié)合1.輔基粗的固播定化過程:將活綱化的渾載體鹽與連樸接臂您連接頌，再疊以適顧當(dāng)反銹應(yīng)與捕輔基突連接易。連接臂活化載體輔基功能基團(tuán)載體就的選虹擇沒有半特異鮮性吸島附具有棟多孔到性有適皂合引史入配況基的諷官能換團(tuán)化學(xué)蠅穩(wěn)定條性具有發(fā)適當(dāng)昏的機(jī)斑械強(qiáng)欺度等他。目前世使用賢的載炭體主拍要是瓊脂挖糖，此認(rèn)外還賀有纖幸維素遍、玻和璃珠頃及合斯成高抽分子幕材料拴等。連接嗚臂的黑選擇需考文慮的誦因素:輔基莫的性委質(zhì):疏水往性、齒親水正性、蟲離子宏性、體積浮大小長度:輔基扯分子畜和載但體之讓間需斜要0.買5-后1.雕0礎(chǔ)nm長的荷手臂腦。用噴較長的疏水烷嘆基作惠手臀英時(shí)，冊(cè)由于至亦有扁吸附摘強(qiáng)的界能力菠、會(huì)信使固劑定化舅輔基惕吸附漲專一賣性降歇低。偶聯(lián)貿(mào)反應(yīng)稠的選占擇利用東輔基竊分子救本身花的功畏能基絨團(tuán)與幫載體棋連接如磷只酸吡唉哆醛(胺)、FA羨D、FM饑N、TP邪P、生物箱素、喚硫辛淺酸、暗卟啉取等引入漸適當(dāng)仗的功共能基譜團(tuán)—不能扒影響查輔基船的活喉性如羧基或氨基等2.輔酶的固壤定化載體肌共價(jià)儀偶聯(lián)蘆：與輔基境的固沫定化債方法調(diào)相似或：捕修飾干后置茂于超蘇濾器引入擇一個(gè)秀功能杏基團(tuán)智，生乏成輔蒜酶的銷衍生伏物——羧基炒或氨受基衍生盞物再遞與水溶末性高劫分子僵聚合神物結(jié)合浩。選擇玻高分棋子化具時(shí)死，要感考慮烈的是拐高分尾子化硬合物法的溶孤解度觸大、勁分子益大小飯適當(dāng)誓，既豈能保煎持在頁半透躁膜內(nèi)蠶，又頓不會(huì)斤過大序地增繪加黏蹦度而側(cè)影響悔活性。必須漲將輔酶固定炸在水溶監(jiān)性載壟體上輔酶分子饅量小宵，難掠以截餓留再在生，拖非常上致密劇的超叼濾膜存才能事阻止造它的裕流失星，這傳樣勢步必增陵加流辮體的鋒流動(dòng)帆阻力達(dá)，降錢低反此應(yīng)產(chǎn)沫率。輔酶分子踢量小鹽，要尸將其廣包埋犧在半震透膜聲比較鐵困難洗；若將鍬其與犬水不承溶性鳴載體魔結(jié)合協(xié)，則該不能瘋在多蜂個(gè)酶爹之間駛起傳典遞作當(dāng)用，迷酶反朱應(yīng)存繭在較益大的汗擴(kuò)散墓阻力周，酶家的表眾觀活無力降拆低，速輔酶火再生詢效率樂降低花。一般彈引入羧基的輔辟酶，懸用羰二貴亞胺縮合攏反應(yīng)隔使其雁與聚Ly搏s、聚乙控亞胺結(jié)合展，形蘭成水徑溶性牽高分迷子化矛合物退；引入氨基的輔壁酶，第一般綢用Br找CN活化業(yè)后，額再與黎水溶搭性多肌糖類(如右旋仿糖苷)結(jié)合抓，而誤高分舒子化翻。3、輔酶營的再良生除了炒將輔賭酶固竊定在筍水溶宏性載無體上險(xiǎn)之外沖，還旅需要灑有一蜜個(gè)適汽宜的恰超濾雙膜反防應(yīng)器爆或中閑空纖倍維反另應(yīng)器啞來截竿留固嫩定化嘉輔酶畫和酶年。原位宋再生——將輔享因子孝始終策截留脊在反杠應(yīng)體寇系，冒通過翠氧化延還原笨等反懶應(yīng)實(shí)袋現(xiàn)輔睜因子跳再生景。輔因懸子再話生——偶合訊另一流種酶懂（如穴醇脫賀氫酶荷）第三問節(jié)藝固定植化細(xì)集胞（Im講mo述bi傾li榴ze訓(xùn)d牢Ce華ll）固定洽化細(xì)魯胞：固定紐奉在載焦體上節(jié)并在攏一定退的空輛間范尊圍內(nèi)銀進(jìn)行映生命當(dāng)活動(dòng)令的細(xì)也胞。辰該細(xì)辦胞能倒進(jìn)行墾正常辮的生粗長、繁繁殖盤和新平陳代蚊謝，領(lǐng)又稱恒固定學(xué)化活臨細(xì)胞斯或固侮定化耐增殖糾細(xì)胞脆。固定迫化細(xì)胞拐仍保這留催粥化活區(qū)性并或具有洪能被寒反復(fù)蕩或連袋續(xù)使董用的徑活力議。固定礦化細(xì)找胞的臭優(yōu)缺楊點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)崇：(1賽)省去兵了酶丘的分律離手欺續(xù)，冷為多魂酶系虹統(tǒng)，無須紅輔因訂子再堅(jiān)生。(2闊)細(xì)胞乖生長憤快且略多、匠反應(yīng)陰快(3掃)可以瀉連續(xù)舊發(fā)酵孟，節(jié)兆約成歪本，尤而且偶在蒸克餾和臉提取庸前不感用分臉離去旺細(xì)胞哲，能黎一邊片排出岡發(fā)酵帽液，案一邊雜進(jìn)行洲培養(yǎng)舍，排孩除了照產(chǎn)物軟抑制達(dá)和消炎耗。(4墊)保持馬酶在雅細(xì)胞吵內(nèi)的聯(lián)原始徑狀況知，增蜘加了個(gè)酶的愉穩(wěn)定性，特延別是報(bào)對(duì)污濕染因扇子的旨抵抗個(gè)力增就加。缺點(diǎn)祝：(1擊)必須蘇保持揮菌體搭的完琴整，尖防止驚菌體睡自溶衰，否旁則，踐將影按響產(chǎn)昨品純放度。(2壤)需抑施制胞孕內(nèi)其爐他酶此的活妙性，礦以阻析止副產(chǎn)退物的形步成。(3飄)細(xì)胞浸膜、慘壁會(huì)菊阻礙堤底物著滲透寸和擴(kuò)尼散。固定愁化細(xì)增胞生決理狀愧態(tài)：⑴固定歷化死差細(xì)胞：一般結(jié)在固自定化狗之前側(cè)或之擔(dān)后細(xì)洽胞經(jīng)來過理攝化方吐法的刑處理混，以流增加皺細(xì)胞氧膜的擱滲透潑性或詳抑制幸副反西應(yīng)，杏比較需適于漲單酶凡催化茅的反燒應(yīng)。⑵固定敞化靜桐止細(xì)罰胞和戴饑餓冰細(xì)胞：在固嶺定化悅之后留細(xì)胞斃是活惜的，灑但是甜由于漏采用溜了控歐制措功施，覽細(xì)胞草處于撇休眠榴狀態(tài)心或饑信餓狀勵(lì)態(tài)。⑶固定向化增闖殖細(xì)量胞：固定途在載府體上銷的活植細(xì)胞寫，在造連續(xù)才反應(yīng)暴過程叢中保都持旺脂盛的炎生長講、繁瀉殖能攤力。但更適哄宜于夠連續(xù)韻使用占，更企適合支于進(jìn)織行多你酶順渡序連早續(xù)反鳳應(yīng)，在發(fā)箱酵工繞業(yè)中販最有扮發(fā)展緒前途。固定白化細(xì)翠胞的烏方法固定使化完餓整細(xì)羅胞還稻沒有粗一種朝理想撞的通餅用方料法。唉對(duì)于發(fā)特定圓的應(yīng)尾用，惡必須促找到與價(jià)格珍低、精簡便牽的方芒法，牌高的拿活力思和操剝作穩(wěn)認(rèn)定性頑。吸附身法：條件鹽溫和另，方孤法簡雷便，戶可再頃生；避但吸周附力扭弱，糖易脫蠟落。包埋梨法：適合士于小下分子蝕底物謎。固閥定增色殖細(xì)越胞此窗法占參優(yōu)勢斥，尤令其采袋用卡哀拉膠德、海張?jiān)逅崞尖}等塔材料妖更好然。微生床物細(xì)性胞的鄭固定瓜化將基違因工味程菌牧固定序化后陪培養(yǎng)捐可提露高基苦因工駱程菌添的穩(wěn)宗定性股和克丙隆基偶因產(chǎn)抽物的濕產(chǎn)量稼。基因蓬工程免菌的冤固定真化推訴動(dòng)了儀固定諒化技領(lǐng)術(shù)的贈(zèng)發(fā)展績。動(dòng)植攤物細(xì)踢胞的舟固定巨化(一)植物愁細(xì)胞昂固定絲式化植物孟細(xì)胞勻比菌銷體細(xì)非胞嬌河嫩得難多，珍需要跳溫和牢的固雕定化咽方法宴。一般蘇采用事吸附刮法和該包埋煎法1．吸抹附法吸附腳在泡沫黨塑料怕的孔洞或考裂縫內(nèi)，垮或吸伶附于中空盟纖維外壁排上。用該法固捕定的宰豌豆遲細(xì)胞坡和胡春蘿卜息細(xì)胞漂進(jìn)行瓣生產(chǎn)濟(jì)多酚稈化含厭物的裝研究喂，可案連續(xù)桶使用1個(gè)多伐月。2．包甜埋法是將邀植物屋細(xì)胞刷包埋少于瓊農(nóng)脂、逝海藻語酸鈣大、聚洞丙烯滿酰胺指、明稠膠和屠角叉饑菜膠亦等多限孔凝晚膠中弓。Br繡od止el足iu甚s等(1庫97罷9)首次進(jìn)用海創(chuàng)藻酸蜓鈣包偽埋制追備了妨固定宏化長沃春花陡等細(xì)返胞。(二)動(dòng)物顛細(xì)胞負(fù)固定擺化吸附愁法轉(zhuǎn)瓶彼法：微載洽體法側(cè)：直濃徑10籠0~諷20尤0u嫩m，相對(duì)概密度夾近1.哭0的顆磚粒，自表面懂大，北傳質(zhì)離好中空踏纖維劍法：包埋挪法：凝膠高包埋擾法：瓊脂攪糖凝暮膠、海藻枕酸鈣需凝膠事、血即纖蛋四白等罷。如用萌一定壟濃度肌的?；逅岱氢}凝澆膠，將與動(dòng)放物細(xì)片胞混殊合均漠勻后炊，用條注射侄器將挽混合隆液滴杰到一場定濃慮度的Ca光Cl2溶液嶺中即愚可。半透服膜包美埋法宇：海藻私酸鈣-聚賴傘氨酸渡（AL漏G-遮PL鍵L）包正埋技肌術(shù)。(三)原生則質(zhì)體投固定乒化微生匠物細(xì)蓄胞和甜植物就細(xì)胞方除去赤細(xì)胞棕壁后誕，可減獲得盞原生蔽質(zhì)體塑，增襯加胞粉內(nèi)物仇質(zhì)的沖分泌吉。固定哈化原溪生質(zhì)建體：夠原生旺質(zhì)體持用多袍孔凝耐膠包薯埋，盯穩(wěn)定絹性提炭高，鞭可免羨至破紋裂。仔也有簡利于陽氧傳殖遞，秘營養(yǎng)很成分覆的吸窩收和衣胞內(nèi)畏產(chǎn)物秀的分索泌。原生扮質(zhì)體才的制者備收集劃對(duì)數(shù)女生長搞期的篇細(xì)胞益，懸里浮在風(fēng)含有惹滲透植壓穩(wěn)麗定劑遺的高孔滲緩趙沖液業(yè)中；加入催適宜綢的細(xì)另胞壁殺水解卻酶;分離賞除去隔細(xì)胞赴壁碎前片、倍未作影用的忽細(xì)胞嘴以及撕細(xì)胞抬壁水集解酶箱，得虎到原抗生質(zhì)圓體。把離坐心收膨集到盤的原拍生質(zhì)餓體重啦新懸確浮在櫻含有辜滲透捐壓穩(wěn)麗定劑文的緩業(yè)沖液鬼中，詳配成常一定黑濃度置的原徐生質(zhì)振體懸淹浮液攜，然疫后采宋用包蘋埋法堡制成陡固定倉化原忽生質(zhì)強(qiáng)體。固定潮化酶小應(yīng)用死實(shí)例固定化酶和固定化細(xì)胞應(yīng)用生產(chǎn)時(shí)間氨基?；窪L-氨基酸的拆分1969葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)變?yōu)楣?973青霉素?；干a(chǎn)6-APA1973天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生產(chǎn)L-蘋果酸1974?-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸?-脫羧酶生產(chǎn)L-丙氨酸1982第四節(jié)固定尿化酶葵的性任質(zhì)及絲式其影類響因吼素一、影響粒固定柳化酶區(qū)（細(xì)繞胞）嘴性質(zhì)相的因肉素1．酶賣本身琴的變惱化：活性羨中心盤的氨劈燕基酸倉殘基殲、高弄級(jí)結(jié)瞇構(gòu)和伙電荷扁狀態(tài)短等發(fā)善生了跟變化少。2．載貿(mào)體的簡影響3.固定掀化方雜法的精影響分配跪效應(yīng)空間產(chǎn)障礙喇效應(yīng)擴(kuò)散蓋限制創(chuàng)效應(yīng)由于醉載體餅和底畝物的仙性質(zhì)渠差異它引起辯了微撿環(huán)境霜和宏豎觀環(huán)幕境之糕間的縮慧性質(zhì)革不同咬。微環(huán)盛境是在殿固定鋪化酶們附近亡的局錘部環(huán)揭境，嶺而將翅主體焦溶液臨稱為宏觀分環(huán)境。由鉛這種寸不同飛造成衰的底物歇、產(chǎn)挑物和菊各種劇效應(yīng)毯物在每兩個(gè)震環(huán)境邊之間貌的不瘋同分座配，穴被稱脈為分如配效灣應(yīng)。⑴分配端效應(yīng)⑵空間屬障礙忽效應(yīng)固定堆化之重后，失由于信酶的另空間巡壽自由顛度受丹到限引制(因?yàn)榈洼d體納的空之隙太藍(lán)小，擊或者主固定熱化方著式與庭位置皺不當(dāng)頸，給汗酶的欠活性麻部位鑼造成吼了空幻玉間屏董障)，使紀(jì)酶分猜子的經(jīng)活性上基團(tuán)蜻不易座與底披物或件效應(yīng)爆物接揭觸，搬影響打酶分炭子的竭活性咬中心扶對(duì)底侵物的房誠定位既作用,所造塑成的文對(duì)固再定化鑰酶的驗(yàn)活力雹的影葡響效僚應(yīng)，棵被稱遲為空雨間障恩礙效跳應(yīng)。酶固盒定化殃使生尚物催溫化反低應(yīng)從困均相硬轉(zhuǎn)化右為多陳相，聯(lián)于是墓產(chǎn)生聽了擴(kuò)熱散阻欲力：1）外尋擴(kuò)散套阻力是底笑物從宏筐觀環(huán)灰境向咽酶顆格粒表面瞇傳遞促過程閘中的楊一種臺(tái)擴(kuò)散伙限制資效應(yīng)巷，它呀發(fā)生扔在反基應(yīng)之脆前，伙發(fā)生寫在固憶定化握顆粒刺周圍帽的液寸膜層袋。它會(huì)胖使底姑物在凍固相際酶周說圍形氏成濃稀度梯冶度，君通過糊增加軍攪拌系速度夫和底會(huì)物流搭速的捆方法阻可以幕減少兔外擴(kuò)順散效精應(yīng)。⑶擴(kuò)散喚限制洞效應(yīng)內(nèi)擴(kuò)梨散阻昆力2）內(nèi)壁擴(kuò)散偶阻力是指晨底物培分子腰達(dá)到固相猴酶表下面后傳艘遞到酶活拘性部希位時(shí)的爸一種剛擴(kuò)散瞎阻力枕，它南與催?；次g應(yīng)同柔時(shí)進(jìn)逮行。載體是小而務(wù)彎曲診的細(xì)孔是產(chǎn)碑生內(nèi)般擴(kuò)散緒阻力饞的主嶼要原站因。拍因此餃?zhǔn)褂盟头质献恿慷涞孜镌?，小竭的粒王徑、梳載體釣孔盡猜可能笑大而仍直且柿互相咸連通撐，或刮僅僅旺將酶釣固定爺在載瘋體表較面都丟可以蓬降低策這種伶內(nèi)擴(kuò)榴散阻屠力。1、固定斗化酶隸的活撈力在取大多沫數(shù)情馳況下濕比天然舒酶下仔降，其學(xué)專一接性也虎會(huì)受劑到影吼響發(fā)盆生改般變。活力和下降四的原尊因：酶分旦子在嘴固定痕化過尚程中皇，酶裂的空死間構(gòu)判像發(fā)簡生了炒變化騾，甚膀至活懇性中惠心的緒氨基榴酸也返會(huì)參金加反腰應(yīng)。固定炮化后反的空眼間障籮礙效或應(yīng)的紡影響核。內(nèi)擴(kuò)均散阻鋼力的及影響扒使底扎物分垂子與蓬活性催中心榴的接漫近受息阻。包埋送法時(shí)窮被高楊分子鋼物質(zhì)撓半透其膜包呀圍。二、固定汗化酶話（細(xì)團(tuán)胞）賤性質(zhì)孩的改變2、固寺定化磚后酶打穩(wěn)定站性提污高穩(wěn)定晃性提疑高的閘表現(xiàn)殊：⑴熱穩(wěn)定村性提采高：棗耐熱困性提核高，艇最適板溫度率提高板，酶偶催化碗反應(yīng)諒能在疼較高賢溫度旁下進(jìn)梢行。⑵對(duì)各藏種有機(jī)刺試劑評(píng)及酶象抑制傾劑的穩(wěn)躺定性立提高懼：使政本來游不能柴在有模機(jī)溶扎劑中惜進(jìn)行帶的酶里反應(yīng)情成為辯可能毅。⑶固定夏化酶裙對(duì)不骨同pH雞(酸度)穩(wěn)定征性、對(duì)蛋閘白酶穩(wěn)定屯性、貯存穩(wěn)定襯性和操作穩(wěn)定腔性都僵有影禽響。舉例:氨基笛?；勖溉軤I液酶秋在75丟℃，15麥mi駝n，失抗活；DE企AE閱-Se手ph管ad丈ex固定弦化酶捎在同咸樣條毯件下障仍有80％；DE顆AE勇-纖維研素固慮定化州酶在六同樣陳條件克下還姻有60利%活力卵。氨基寸?；⒚冈谟蛞鹊暗郯酌干底饔媒禄疃d力僅令存20％，船而將軟其固煩定于DE麻AE癢-纖維淋素上想在同考樣條赤件下掠仍有80％的假活力含。固定裳化木女瓜蛋蓬白酶(瓊脂)在4℃下，12復(fù)0天酶住活力側(cè)無變戒化。穩(wěn)定當(dāng)性提庭高的原因?yàn)常汗潭▊セ筇缘拿给B與載科體多茄點(diǎn)連死接，可極防止傷酶分糊子伸琴展變兵形。皮增加奧了酶棕活性徒構(gòu)象燙的牢邊固程以度。酶活仇力的縣緩慢觸釋放洋。抑制潤酶的座自身叨降解心。酶與葉載體文結(jié)合很后失訂去了催分子禍間相藥互作裹用的撓機(jī)會(huì)榮，抑綢制了塵其自泛身的口降解買過程膚。固定腰化部赤分一燈定程擁度上蔽阻擋各了外狠界不言利因這素對(duì)寶酶的毛侵襲憲。3、固文定化逐酶（項(xiàng)細(xì)胞奔）的紹作用pH變化酶固鑰定化泄后，歐對(duì)底漆物的終最適pH曲線瞞常常怒發(fā)生逝偏移晝。一般陣來說去，帶負(fù)暢電荷語載體制備饅的固羨定化暑酶，女其最適pH值較魚游離械酶偏職高，這誘是因志為多甩聚陰交離子捧載體像會(huì)吸咱引溶播液中詞陽離捆子，病包括H+，使其晨附著腹于載健體表珍面，沒結(jié)果謎使固墻定化惕酶擴(kuò)衛(wèi)散層H+濃度懷比周蹄圍的礙外部晉溶液難高，別即偏肉酸，噴這樣憶外部冠溶液紫中的pH必須跌向堿串性偏厘移，幣才能憤抵消蓋微環(huán)圾境作撫用，鵲使其圾表現(xiàn)括出酶抵的最爸大活祖力。反之佛，若乒使用帶正繪電荷攀載體的話危，其最適pH值較糞游離震酶偏卸低，即弟向酸丈性偏箭移。4、固插定化魔酶（棄細(xì)胞既）的浙最適晃溫度多的變除化酶反雹應(yīng)的釋最適館溫度黎是酶成熱穩(wěn)慨定性兆與反旦應(yīng)速菠度的巖綜合次結(jié)果栽。因羅為固明定化直后，恒酶的虧熱穩(wěn)輔定性禾提高撞，所四以最適傅溫度交也隨盟之提蚊高，這縣是很捧有利技的結(jié)深果。5、米氏裝常數(shù)Km的變舟化固定嶼化酶暮的表怎觀米收氏常個(gè)數(shù)Km隨載棍體的叢帶電冊(cè)性能相變化建。由于漸高級(jí)胳結(jié)構(gòu)綱變化窄及載祝體影岔響引侵起酶與妄底物做親和呢力變軟化，從磁而使Km變化耽。而膚這種Km變化潛又受伴到溶紹液中至離子饒強(qiáng)度西影響發(fā)：離浸子強(qiáng)尋度升桿高，脹載體腰周圍盡的靜季電梯水度逐炎漸減滑小，Km變化財(cái)也逐戰(zhàn)漸縮產(chǎn)小以苦至消木失。6．香底物鞠特異勿性變秘化作用沸于低儀分子前底物區(qū)的酶特異雅性沒攀有明跪顯變刺化既可路作用腸于低謝分子潛底物下又可兆作用未于大程分子姓低物福的酶特異造性往痰往會(huì)拘變化軍。三、評(píng)價(jià)艦固定獄化酶判的指剛標(biāo)：1.固定徐化酶脆（細(xì)嚷胞）媽的活上力固定瓜化酶礙的活每力即降是固店定化蝦酶催翻化某賊一特租定化將學(xué)反辜應(yīng)的毀能力浮。其朱大小農(nóng)可以含用在撞一定趁條件兔下它亡所催冤化的載某一