淺論丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植后卵泡存活率的影響及其作用機(jī)制

淺論丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植后卵泡存活率的影響及其作用機(jī)制【摘要】目的：探討丹參注射液對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植缺血低氧損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法：收集B6C2F1第1天新生(D1)小鼠卵巢，慢凍速融后移植至B6C2F1代8～12周雄鼠的腎被膜下，移植后小鼠按給藥不同分為對(duì)照組和丹參組，分別于移植后1d、2d(48h)和14d回收移植物，進(jìn)行超氧化物歧化酶及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的RT-PCR半定量測定，同時(shí)移植后14d回收移植物做HE染色全卵巢卵泡計(jì)數(shù)及PCNA免疫組化分析。結(jié)果：移植后各時(shí)間段卵巢組織SODmRNA的表達(dá)，丹參組均高于對(duì)照組，而iNOSmRNA的表達(dá)則均低于對(duì)照組。移植后14d回收全卵巢總卵泡數(shù)，丹參組多于對(duì)照組，P＜；卵泡存活率，丹參組顯著高于對(duì)照組，P＜。結(jié)論：丹參注射液可能通過上調(diào)SODmRNA的表達(dá)，抑制iNOSmRNA的表達(dá)而改善凍融小鼠卵巢同種異體移植缺血低氧性損傷，從而提高卵泡的存活率。

【關(guān)鍵詞】丹參；卵巢；冷凍保存；移植

Abstract:Objective:Toexploretheprotectiveeffectsofdansheninjectiononischemiainjuryinheterotopicallygraftednewbornmouseovaries.Methods:OvariesfromB6C2F1newbornmicewerecryopreservationandthethawedovariesweretransplantatedintokidneycapsulesof8～12wadultmalemiceweredividedintotwogroups:controlgroupanddanshenrecipientmiceweresacrificedon1d，2dand14drespectivelyaftertransplantation.Thegraftsfrom1d，2dand14dwereremovedtoassessthemRNAexpressionsofSODandiNOSwithRT-PCR.Meanwhile，thegraftsfrom14dwereprocessedhistologicallyforfolliclecountingandimmunohistochemicallyforPCNA.Results:SOD-mRNAexpressionofovariantissueinthedurationperiodaftertransplantationwerehigherthanthatofdanshengroup，andtheiNOS-mRNAexpressionwerelowerthanthatofcontrolgroup.Numberoffolliclesin2weekoldgraftsaftertransplan-tationofdanshengroupwasmorethanthatofcontrolgroup.Therewasansignificantimprovementinsurvivalratefrom%to%ifhostanimalsweretobeadministeredwithdansheninjection.Conclusion:DansheninjectionmayimprovedthesurvivalrateofovariesbyreducingischeamiainjuryinheterotopicallygraftednewbornmouseovarieswiththeincreaseofSOD-mRNAexpressionandthedecreaseofiNOS-mRNAexpression.

Keywords:danshen；ovary；cryopreservation；transplantation

半個(gè)世紀(jì)以來的研究表明，卵巢組織的冷凍保存和卵巢移植是目前保留癌癥患者生育能力的較好方法[1]。移植后缺血低氧損傷導(dǎo)致的大量卵泡丟失仍然是阻礙移植卵巢組織功能恢復(fù)的關(guān)鍵問題，其機(jī)制可能是移植物中脂質(zhì)過氧化和其他氧自由基所造成的缺血低氧損傷。丹參是一種常用的活血化瘀中藥，它能清除自由基、改善血流變化和微循環(huán)狀態(tài)。許多研究表明，丹參對(duì)心、肝、肺等多種組織器官的缺血損傷具有明顯的改善作用，但對(duì)于凍融卵巢組織移植過程中缺血低氧導(dǎo)致卵泡損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察丹參注射液對(duì)凍融小鼠卵巢移植早期缺血低氧卵泡損傷的保護(hù)作用及相關(guān)基因超氧化物歧化酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)影響，探討丹參的外源性保護(hù)作用及其與移植物低氧相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系。為進(jìn)一步探討如何降低凍融卵巢組織移植早期缺血低氧損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠，小鼠購自中國科學(xué)院國家嚙齒動(dòng)物研究中心上海分中心上海斯萊克斯有限公司。供體為8～10周齡C57BL/6j雌鼠和10～12周齡BALB/c雄鼠雜交的F1代第1天小鼠卵巢，受體為F1代8～12周雄鼠。

主要試劑與設(shè)備丹參注射液；Leibovitz-15、胎牛血清、DMSO；兔抗增殖細(xì)胞核抗原多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒；反轉(zhuǎn)錄試劑盒；KRYO10-22seriesⅢ程序冷凍儀(英國Planer公司)；ThemoHybaidPCR儀(英國TECHNE公司)。

實(shí)驗(yàn)方法

卵巢的收集，低溫保存和解凍：斷頸處死1日齡受體雌鼠，體視顯微鏡下分離卵巢，放入L15液中，去掉卵巢周圍的包膜，卵巢轉(zhuǎn)移至冷凍液下進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)。卵泡分類①單層扁平顆粒細(xì)胞圍繞卵母細(xì)胞的為原始卵泡。②單層立方顆粒細(xì)胞圍繞卵母細(xì)胞的為初級(jí)卵泡。③兩層或以上立方顆粒細(xì)胞圍繞卵母細(xì)胞，無竇腔的為次級(jí)卵泡。④兩層以上顆粒細(xì)胞，卵泡內(nèi)有竇腔形成為竇卵泡。為避免卵泡重復(fù)計(jì)數(shù)，只計(jì)數(shù)有卵母細(xì)胞核的卵泡。各組卵泡總數(shù)與新鮮組卵巢卵泡總數(shù)的比為卵泡存活率。

PCNA免疫組化分析：移植后14d回收的卵巢組織常規(guī)固定包埋，5μm連續(xù)切片每隔10張切片取一張按試劑盒說明進(jìn)行免疫組化染色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判斷：陽性呈棕褐色定位于細(xì)胞核內(nèi)，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。每張切片在200倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性指數(shù)。

RT-PCR檢測SODmRNA、iNOSmRNA表達(dá)：用Trizol一步法提取總RNA。M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo(dT)18primer逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。測定SODmRNA、iNOSmRNA以及actinmRNA含量，引物見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，通過凝膠掃描和QuantityOne電泳成像分析軟件進(jìn)行條帶分析，將目的基因與內(nèi)參β-actinmRNA條帶的比值作為目的基因mRNA水平的參數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法卵泡計(jì)數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩組間SODmRNA和iNOSmRNA基因表達(dá)采用兩樣本的t檢驗(yàn)分析。

2結(jié)果

全卵巢卵泡計(jì)數(shù)移植后14d新鮮卵巢組(見圖1a)中原始卵泡成簇排列，明顯多于對(duì)照組和丹參組。移植后14d回收全卵巢卵泡計(jì)數(shù)丹參組多于對(duì)照組，且原始卵泡、初級(jí)卵泡、竇前卵泡及竇卵泡各級(jí)卵泡數(shù)均多于對(duì)照組，差異存在顯著性。卵泡存活率丹參組顯著高于對(duì)照組，兩移植組均比移植后14d新鮮組卵泡數(shù)顯著減少。詳見表2。

PCNA免疫組化結(jié)果陽性呈棕褐色，定位于初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和卵細(xì)胞核內(nèi)，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。對(duì)照組陽性率為85%～90%，丹參組為80%～85%，兩組差異無顯著性。見圖2。

SODmRNA和iNOSmRNA的基因表達(dá)SODmRNA的表達(dá)在移植后的三個(gè)時(shí)間段，丹參組均明顯高于對(duì)照組，卵巢移植后的各時(shí)間段均有iNOSmRNA的表達(dá)，在對(duì)照組中，第1天iNOSmRNA開始升高，第2天達(dá)到最高值，第14天有所下降，與對(duì)照組相比，丹參組的iNOS表達(dá)降低，兩組差異存在顯著性，見表3、圖3。

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凍融新生小鼠卵巢異體移植能存活，且原始卵泡能生長發(fā)育至各級(jí)卵泡。PCNA又稱周期素，與細(xì)胞增殖和DNA合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)PCNA陽性表達(dá)與Oktay等研究結(jié)果相一致，見于初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及竇卵泡的顆粒細(xì)胞及初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞，原始卵泡未見PCNA的表達(dá)。兩組移植后14d的卵巢組織PCNA的陽性表達(dá)均較高，說明移植的卵巢組織均處于良好的生長發(fā)育狀態(tài)，但移植后14d回收的兩組移植卵巢總卵泡數(shù)明顯少于移植后14d新鮮小鼠卵巢的總卵泡數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)了卵巢組織移植過程中由于無直接血管吻合導(dǎo)致的缺血低氧會(huì)損失很大一部分的卵泡[4-5]。本實(shí)驗(yàn)中我們把凍融小鼠卵巢移植至受體小鼠具有豐富血管的腎被膜下，但移植卵巢需要在其周圍重新形成血管網(wǎng)才能恢復(fù)血供，在移植后至血管形成期間卵巢組織由于缺血低氧將導(dǎo)致卵泡的大量丟失，其機(jī)制可能與活性氧ROS的釋放有關(guān)。許多領(lǐng)域的研究已經(jīng)證實(shí)ROS清除劑可以抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。丹參中所含主要活性成分丹參酚等酚類，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑，因此我們將其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示丹參組移植后14d回收卵巢總卵泡數(shù)多于對(duì)照組，各級(jí)卵泡數(shù)也存在明顯差異，且丹參組的卵泡存活率達(dá)%，顯著高于對(duì)照組的卵泡存活率的%，說明丹參能減輕凍融卵巢移植后的缺血低氧損傷，提高卵泡存活率。

SOD是一類金屬酶，廣泛存在于不需氧的生物組織中，它能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫和氧，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力的高低間接反映了機(jī)體消除氧自由基的能力。丹參是一種強(qiáng)抗氧化劑，它的保護(hù)作用可能是抑制自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。王宇等在大鼠肝的冷凍灌注保存液中加入丹參注射液，然后進(jìn)行大鼠原位肝移植，發(fā)現(xiàn)丹參組肝組織中的SOD活性明顯升高，肝組織缺血再灌注程度減輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示丹參組各時(shí)間段移植卵巢組織中的SODmRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，說明了丹參注射液可能通過增高移植卵巢組織中SOD活性，清除氧自由基，對(duì)防治凍融卵巢移植后的缺血低氧損傷起到積極的作用。

NO和NOS與缺血再灌注損傷的關(guān)系密切。NO是一種半衰期很短的自由基氣體，低濃度的NO對(duì)組織具有保護(hù)作用，而高濃度狀態(tài)下對(duì)組織有損害作用。NO是由NOS催化生成的，NOS分為三型：nNOS、eNOS和iNOS，前兩者的激活均依賴于鈣離子和鈣調(diào)蛋白的作用；iNOS在基態(tài)下不表達(dá)，可由炎癥因子、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)激活，作用時(shí)間長，可催化生成大量NO。Matsumi等發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)不成熟的大鼠卵泡顆粒細(xì)胞中存在iNOS。聶瑩雪等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，iNOS在缺血l2h時(shí)開始增加，隨著缺血時(shí)間的延長其表達(dá)也逐漸增加。張瑩等將丹參注射液注射至重癥胰腺炎大鼠模型體內(nèi)來觀察iNOS基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參早期治療能抑制iNOS表達(dá)從而起到保護(hù)胰腺的作用。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在卵巢移植后的各時(shí)間段均有iNOSmRNA的表達(dá)，在對(duì)照組中，第1天iNOS開始升高，第2天達(dá)到最高值，第14天有所下降，說明iNOS參與了卵巢移植后缺血損傷的過程。與對(duì)照組相比，丹參組的iNOS表達(dá)降低，兩組差異存在顯著性，提示丹參注射液可能通過下調(diào)iNOSmRNA的表達(dá)從而抑制NO的過度產(chǎn)生，對(duì)卵巢移植后的缺血-再灌注損傷起保護(hù)作用。

綜上所述，凍融新生小鼠卵巢同種異體移植原始卵泡能存活并生長發(fā)育至各級(jí)卵泡，但移植早期的缺血低氧造成大量卵泡的丟失。丹參可能通過上調(diào)SODmRNA的表達(dá)，清除氧自由基，下調(diào)iNOSmRNA的表達(dá)，抑制NO過度產(chǎn)生而對(duì)卵巢移植后的缺血低氧損傷起保護(hù)作用，從而提高卵巢移植后的卵泡存活率。

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