DB35T 1555-2016水仙黃條病毒、水仙花葉病毒和水仙潛隱病毒 多重RT-PCR 檢測(cè)方法

ICS65.020.01B16DB35福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T1555—2016水仙黃條病毒、水仙花葉病毒和水仙潛隱病毒

多重RT-PCR檢測(cè)方法MultiplexRT-PCRMethodofNarcissusyellowstripevirus,Narcissusmosaicvirusand

Narcissuslatentvirus2016-07-06實(shí)施2016-04-062016-07-06實(shí)施福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局DB35/T1555—2016本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》給岀的規(guī)則編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)由福建岀入境檢驗(yàn)檢疫局提岀并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建岀入境檢驗(yàn)檢疫局、福建農(nóng)林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：沈建國(guó)、高芳鑾、金晶、李敏、虞贊、陳細(xì)紅、陳壽鈴。DB35/T1555DB35/T1555—2016#DB35/T1555—2016附錄A(資料性附錄)水仙黃條病毒、水仙花葉病毒、水仙潛隱病毒的背景資料A.1分類地位水仙黃條病毒：學(xué)名：Narcissusyellowstripevirus,縮寫(xiě)：NYSV。分類地位：馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus。水仙花葉病毒：學(xué)名：Narcissusmosaicvirus，縮寫(xiě)：NMV。分類地位：線性病毒科(Flexiviridae)、馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)。水仙潛隱病毒：學(xué)名：Narcissuslatentvirus，縮寫(xiě)：NLV。分類地位：馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、柘橙病毒屬(Macluravirus)。A.2寄主范圍NYSV:自然寄主目前已報(bào)道的主要為水仙屬(Narcissusspp.)的水仙。NMV：自然寄主目前已報(bào)道的主要為黃水仙(Narcissuspseudonarcissus)?NLV：自然寄主目前己報(bào)道的主要為黃水仙(Narcissuspseudonarcissus)、鴦尾(Irisxiphium)、劍蘭(Gladiolushybrids)、根希百合(Nerinesarniensis)。A.3病害癥狀NYSV：典型癥狀為沿葉脈產(chǎn)生褪綠黃色條斑，系統(tǒng)花葉，病葉表面有凸起，花梗產(chǎn)生褪綠斑，病株花朵著色不均，最后導(dǎo)致鱗莖變小、植株矮化，直至提前枯萎。NMV：初期無(wú)癥狀或葉片上部?jī)H有輕微的不規(guī)則褪綠小斑，但隨著病情加重，病斑表現(xiàn)明顯的花葉,并擴(kuò)展為較大的斑塊。發(fā)病膺童時(shí):，引起葉片扭曲、黃化，植株矮小畸形，鱗莖變小，種球退化。NLV：?jiǎn)为?dú)侵染水仙后引起葉片頂端產(chǎn)生褪綠黃色條斑，與其他病毒復(fù)合侵染時(shí)導(dǎo)致水仙植株岀現(xiàn)花葉、斑駁、黃化、壞死、花箭減少、香味變淡以及矮化畸形等癥狀。A.4分布地區(qū)NYSV：主要分布于英國(guó)、荷蘭、立陶宛、美國(guó)、新西蘭、中團(tuán)。NMV：主要分布于英國(guó)、荷蘭、中國(guó)。NLV：主要分布于英國(guó)、荷蘭、德國(guó)、意大利、以色列、澳大利亞：中H?'A.5傳播途徑NYSV：汁液接觸、螃蟲(chóng)傳播。NMV：汁液接觸。NLV：汁液接觸、螃蟲(chóng)傳播。DB35/T1555DB35/T1555—201655DB35/T1555DB35/T1555—2016A.6粒體形態(tài)NYSV:病毒粒體為線條狀，大小約755nmX12nm,粒體形態(tài)見(jiàn)圖A.1。NMV：病毒粒體為線條狀，大小約550nmX13nm,粒體形態(tài)見(jiàn)圖A.2。NLV：病毒粒體為線狀，大小約650nmX13nm,粒體形態(tài)見(jiàn)圖A.3。注：弓丨自注：引自注：弓丨自注：弓丨自注：引自注：弓丨自圖A.1NYSV病毒粒體圖A.1NYSV病毒粒體圖A.2NMV病毒粒體圖A.3NLV病毒粒體A.7病毒基因組NYSV:正義單鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約9650bp。NMV:正義單鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約6955bp。NLV:正義單鏈RNA病毒，全長(zhǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。附錄B（規(guī)范性附錄）

多重RT-PCR檢測(cè)方法B.1試劑B.1.1TrizoL裂解液B.1.25xTBE緩沖液Tris堿54.0g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL補(bǔ)充蒸餾水至1LB.2實(shí)驗(yàn)步驟B.2.1總RNA提取稱取0.1g待檢樣品，用液氮研磨成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL離心管中，并加入1mLTrizoL裂解液，劇烈振蕩后，室溫靜置5min；4°C,12000g離心10min，取上清；加入氯仿200卩L,劇烈震蕩15s,室溫靜置3min,4°C,12000g離心15min,取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置5min,4°C,12000g離心10min,棄上清；加入1mL75%的乙醇洗滌沉淀2次，每次4°C,7500g離心5min,棄上清；RNA沉淀干燥后，用20uL?40卩L經(jīng)DEPC（焦碳酸二乙酯）處理過(guò)的雙蒸水（dd足0）溶解，-20°C保存?zhèn)溆?。B.2.2RT-PCR反應(yīng)B.2.2.1引物序列表B.1引物序列病毒名稱引物序列目的條帶大小水仙黃條病毒NYSV-f:5'-AAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3'NYSV-r:5'-CCATCCAGCCCAAATAAG-3'668bp水仙花葉病毒NMV-f：5z-CGCTCGACAGTTTTACGT-3'NMV-r：5z-TCTGGAGGTGCTTCAATG-3'372bp水仙潛隱病毒NLV-f：5z-GATGCGACTGCTCAAGGC-3'NLV-r：5z-CAGGCTGTCATTTGCTTACC-3'554bpB.2.2.2cDNA合成DB35/T1555DB35/T1555—2016DB35/T1555DB35/T1555—201666在PCR管中加入3卩L總RNA,0.5uL各病毒下游引物，95°C水浴7min,迅速冰浴5min，再加入5XRT緩沖液2.5uL、dNTP(10mmol/L)0.5uL>M-MLVRT(200U/uL)0.5uL、RNasin(40U/uL)0.5uL和ddH。2.5uL。37C水浴60min,95C水浴10min,自然冷卻至室溫，-20C保存?zhèn)溆?。B.2.2.3PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表B.2,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。檢測(cè)時(shí)以含有各病毒目標(biāo)片段的質(zhì)?；蚝《静牧献鳛殛?yáng)性對(duì)照，以不含病毒的健康植物組織作陰性對(duì)照，同時(shí)以水代替模板作為空白對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：94C預(yù)變性3min，然后94C變性45s、50C退火45s、72C延伸60s，35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72C繼續(xù)延伸10min。表B.2PCR反應(yīng)體系名稱加樣量/uL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.0TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.5dNTPs(10mmol/L)0.510XPCR緩沖液(Mg2+Free)2.5MgCl2(25mmol/L)1.5NYSV-f(10nmol/uL)1.2NYSV-r(10nmol/uL)1.2NMV-f(10nmol/uL)0.8NMV-r(10nmol/uL)0.8NLV-f(10umol/uL)0.5NLV-r(10umol/uL)0.5ddH2O12.0總體積25B.2.3陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照的設(shè)置陰性對(duì)照：不含病毒的健康植物組織；陽(yáng)性對(duì)照：含有水仙黃條病毒t水仙花葉病毒、水仙潛隱病毒的植物組織；空白對(duì)照：ddH=0?B.2.4瓊脂糖凝膠電泳制備1.5%的瓊脂糖凝膠，然后將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按比例混合均勻，加入到樣品孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作分子量標(biāo)記，進(jìn)行電泳。當(dāng)漠酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約0.5cm時(shí)，停止電泳，在裝有濃度為0.5ug/uL的漠化乙錠（EB）溶液的容器中染色，然后在清水中清洗，再在凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否擴(kuò)增岀預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍照，并保存照片。B.3結(jié)果判斷如果陽(yáng)性對(duì)照有特異性條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增，待測(cè)