生物文獻(xiàn)翻譯-來(lái)自凋亡血小板中的微粒能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化

來(lái)自凋亡血小板中的微粒能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化血小板釋放出的微粒不僅是活化的，而且像細(xì)胞凋亡一樣處于老化狀態(tài)（apoptosis-inducedplateletmicroparticles,PMap）。雖然誘發(fā)活化的微粒已經(jīng)被廣泛的研究，但是關(guān)于其PM叩構(gòu)造形成的生理學(xué)影響目前還不被了解。流式細(xì)胞術(shù)和掃描電鏡表明PMap呈現(xiàn)激活整合蛋白和影響微粒聚合形成的作用。PMap對(duì)單核細(xì)胞具有趨化現(xiàn)象，能夠束縛于這些細(xì)胞，此外能夠刺激細(xì)胞粘附和附著于纖粘連蛋白表面。在持久的潛伏之后，PMaDap能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化，但抑制細(xì)胞的增殖。單核細(xì)胞膜受體分析顯示增加了CD11b（integrinaMb2），CD14和CD31（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1）的表達(dá)水平，和趨化因子受體CCR5和CXCR4的表達(dá)水平，但是CCR2沒(méi)有變化。這表明PM叩能夠?qū)⒓?xì)胞趨極化駐留在M2單核細(xì)胞上。應(yīng)對(duì)PM叩的細(xì)胞積極消耗氧化低密度脂蛋白（oxLDL），并釋放蛋白酶和過(guò)氧化氫。進(jìn)一步證實(shí)發(fā)現(xiàn)分化朝向PM叩刺激（ox）LDL受體，CD36和CD68,炎癥細(xì)胞因子和單核細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子等定向?qū)Ｓ型淌杉?xì)胞方向?？傊?，PM叩與單核細(xì)胞之間的相互作用具有一種免疫調(diào)節(jié)的可能性。這種細(xì)胞凋亡微粒能夠使細(xì)胞向駐留M2子集方向極化，并且導(dǎo)致朝定向?qū)Ｐ酝淌杉?xì)胞方向進(jìn)化。在富含血小板的血漿中微粒的存在早在60年代已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了，這些之前被稱(chēng)為血小板塵埃。從那時(shí)起，在血栓形成和止血生理途徑中由血小板導(dǎo)出的微粒所扮演的角色已經(jīng)被較好的確定下來(lái)。在正常的外周血也中循環(huán)流動(dòng)的血小板微粒支持低水平的凝血酶的產(chǎn)生。在外科手術(shù)之后和血栓形成的條件下，在血漿中的微粒水平顯著增加，而且這與心血管疾病、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的病理學(xué)作用有關(guān)。這些微粒的形成被認(rèn)為是用強(qiáng)有效的激活劑激活血小板而產(chǎn)生的結(jié)果，在體外用一種強(qiáng)效促凝血電位刺激會(huì)引起被激活的微粒大量脫離流失。血液中血小板的循環(huán)周期是9-10天，而且被脾臟清除或者是經(jīng)歷一種像細(xì)胞凋亡一樣的過(guò)程。這種由時(shí)間誘發(fā)的血小板細(xì)胞凋亡也導(dǎo)致微粒的流失，但是顯然，這個(gè)過(guò)程不存在血小板激活信號(hào)。因此，在血液中隨著年齡的增加存在一種PMap（apoptosis-inducedplateletmicroparticles）的持續(xù)形成，表面上看似是一些沉默了的血小板。吞噬細(xì)胞，包括單核白細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡血小板的清除工作和在循環(huán)中PMap的清除工作。條件性的刺激血小板細(xì)胞凋亡或者吞噬作用的抑制今后也將增加血漿中PMap的水平，將加劇與炎癥有關(guān)的疾病發(fā)生像動(dòng)脈粥樣硬化。很多已經(jīng)注意到激活血小板產(chǎn)生的微粒。例如，他們具有高水平促凝血的潛能特點(diǎn)，他們具有許多生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)組——包括CCL5,CXCL4和CXCL7——這些都已經(jīng)被闡明而且他們近來(lái)發(fā)現(xiàn)能夠提高血管原的早期分支細(xì)胞的瓦薩再生能力。相反的是，很少有相關(guān)的知識(shí)是關(guān)于自然形成的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的微粒,PMap的生物學(xué)效應(yīng)。這里，我們假設(shè)PMap在與白血球相互作用中，特別是單核細(xì)胞的作用中起到免疫調(diào)節(jié)劑的角色。我們的目的是通過(guò)描述PMap和單核細(xì)胞及原單核細(xì)胞之間長(zhǎng)期和短期的相互作用來(lái)確定PMap。結(jié)果單核細(xì)胞與PMap的相互作用包含微粒而不含血小板的血漿與含有血小板，沒(méi)有通過(guò)血小板活化作用、僅僅依靠時(shí)間而流出細(xì)胞凋亡的微粒（圖1，左面）的血漿濃縮液分離（儲(chǔ)存5天），可使用作為血小板特有的細(xì)胞標(biāo)記CD61（glycoprotein（GP）Ilia表達(dá)利用流式細(xì)胞術(shù)直觀(guān)的觀(guān)察結(jié)果（圖1，右圖）。用顯微鏡觀(guān)察血漿中PMap的存在和完整血小板的缺失。利用微孔過(guò)濾（0.8mm）和超速離心的方法相結(jié)合移除完整的血小板，PMap被分離出來(lái)并且以流式細(xì)胞術(shù)為特點(diǎn)，與新鮮孤立的血小板作為參照。PMap部分主要包含＜1mm的部分，但也有一定數(shù)量的較大尺寸部分（圖1b）。這些較大的部分可能是聚合的PMap，這些較大的部分可通過(guò)掃描電子顯微鏡來(lái)顯示單一或者聚集微粒的存在（圖1c）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步表明CD61在PMap中的表達(dá)水平要比休眠的血小板中要低（匹配不同尺寸），并且活化的GPIIb/IIIa（檢測(cè)PAC1單克隆抗體）在Pmap中要高（圖1d和e）。在Pmap中強(qiáng)效激活標(biāo)記物的表達(dá)，例如，CD62P（P-selectin）和磷脂酰絲氨酸（annexinA5binding），與休眠體血小板相比是增加的。同時(shí)，這表明Pmap呈現(xiàn)了一種促凝血磷脂質(zhì)的激活狀態(tài)和活化整合蛋白，從而解釋了他們能夠形成聚集體的能力。然后我們檢測(cè)了PMap捆綁THP-1細(xì)胞的能力，建立了單核細(xì)胞系。電子顯微鏡檢測(cè)共孵育微粒THP-1細(xì)胞表面的多個(gè)PMap（圖2a）。流式細(xì)胞術(shù)使用抗CD61mAb表明捆綁于細(xì)胞上的PMap在30分鐘和70分鐘之間增加了（圖2b和c）。在之后的時(shí)間里，在細(xì)胞表面的CD61結(jié)合位點(diǎn)又減少了。這表明PMap通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞了，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀(guān)察揭示PMap位于THP-1細(xì)胞的表面和胞質(zhì)中（圖2d和支持論點(diǎn)的電影）。在熱處理PMap之后（56°C30分鐘，數(shù)據(jù)未提供），捆綁結(jié)合完全消失，表明PMap表面的活性粘附因子與單核細(xì)胞相互作用是必要的。為了確定PMap是否包含對(duì)血液細(xì)胞的生物活性，我們使用磷酸酯膜遷移實(shí)驗(yàn)來(lái)探索其在THP-1細(xì)胞中的區(qū)劃性。引人注意的是，與參照趨化因子CCL2（圖2e）相比，PMap能夠引起健康細(xì)胞的遷移，這表明微粒具有強(qiáng)烈的趨化潛力。為了進(jìn)一步確認(rèn)來(lái)自PMap的電位介體，我們采用了CCL5和CXCL7的抑制性抗體，這兩種血小板衍生趨化因子表明了tomediate單核細(xì)胞的補(bǔ)充。THP-1細(xì)胞對(duì)PMap的趨化性能夠有效地被CCL5的抗體所阻遏，然而CXCL7抗體或者同型抗體卻沒(méi)任何影響（圖2e）。這就表明CCL5是介導(dǎo)單核細(xì)胞朝PMap方向遷移的主要因素。在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)狀態(tài)下單核細(xì)胞誘導(dǎo)PMap的粘附。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明單核細(xì)胞與PMap的功能交互影響。具有PMap（44小時(shí)）的THP-1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致了顯著的增加一一在靜態(tài)條件下對(duì)纖連蛋白表面穩(wěn)固的粘附。這種效果對(duì)PMA潛伏具有同樣的影響（圖3a）。它通常會(huì)增加PMap更高的數(shù)值，然而PMap制劑的上清液是不活躍的。而且，靜態(tài)血小板的預(yù)培養(yǎng)，增加了相似的數(shù)值，并不會(huì)影響粘附力。作為血小板自發(fā)流出的PMap，即PMap的第一代，在靜態(tài)血小板共孵育實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能影響我們的發(fā)現(xiàn)（圖1a）。為了排除這些自發(fā)產(chǎn)生的PMap的潛在影響，我們首先確定在7天之后PMap形成的數(shù)量，相對(duì)于我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通常使用的PMap數(shù)量的10/1（圖3b）。在asubsequent粘附試驗(yàn)中，我們將10/1比例的PMap和自然釋放的PMap的功能影響進(jìn)行比較。正如所預(yù)料的那樣，微小數(shù)量的PMap是不會(huì)存在任何影響的（圖3c）。PMap在主要細(xì)胞的粘附方面的影響被研究了在生理?xiàng)l件下低剪切力對(duì)人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞單層匯合的影響。PMap的共孵育（44小時(shí)）戲劇性地刺激了分離的單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的粘附，然而在相似條件下與血小板的共孵育卻沒(méi)影響（圖3d）。因此PMap治療對(duì)單核細(xì)胞系和原始單核細(xì)胞的粘附性起刺激作用。PMap對(duì)專(zhuān)性定位吞噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在短期或者長(zhǎng)期與或者不與PMap共孵育之后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)研究單核細(xì)胞表面受體的變化。PMap的存在漸漸地增加了CD11b，CD14和CD31的表達(dá)水平，以相似的方式對(duì)THP-1細(xì)胞和原始單核細(xì)胞處理（圖4b）。在44小時(shí)之后，PMap的存在對(duì)THP-1細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)CCR2表達(dá)水平起抑制作用，盡管這種受體的表達(dá)在7天之后恢復(fù)了。相比之下，在THP-1細(xì)胞中PMap能夠顯著的增加CCR5的水平，但是在原始單核細(xì)胞中這種促進(jìn)是不存在的，而且在THP-1細(xì)胞和原始單核細(xì)胞中能夠增加CXCR4水平（圖4a和b）。這個(gè)共同點(diǎn)表明PMap治療單核細(xì)胞趨向于承擔(dān)M2單核細(xì)胞表型，這一點(diǎn)以前解釋為CD14+CD16+CCR2+CCR5+CXCR4++。CD16的表達(dá)水平在我們的實(shí)驗(yàn)中仍然沒(méi)有改變（圖4a和b）。具有PMap的THP-1細(xì)胞較長(zhǎng)的潛伏刺激纖連蛋白在細(xì)胞表面的蔓延（圖5a）。涉及filopods和lamellipods形成的傳播，作為肌動(dòng)蛋白絲與著色的肌動(dòng)蛋白探針、鬼筆環(huán)肽結(jié)合（圖5a）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)PMap的出現(xiàn)本質(zhì)上廢除了THP-1細(xì)胞的擴(kuò)散增殖（圖5b）?？刂颇义V的著色表明在經(jīng)過(guò)PMA、pmap或者休眠血小板處理之后有大概6%-7%的壞死細(xì)胞存在（圖5c）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)支持這樣的結(jié)論——在PMap存在的情況下THP-1發(fā)展成一個(gè)穩(wěn)定的，沒(méi)有增殖的吞噬作用表型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定了向?qū)Ｐ酝淌杉?xì)胞分化。延長(zhǎng)時(shí)間，用PMap處理THP-1細(xì)胞7天潛伏，但是沒(méi)有休眠血小板的存在，增加了氧化低密度脂蛋白的吸收（oxDL；圖5d）。與此相同的是，在PMap存在的條件下oxDL和LDL的受體CD36和CD68的表面表達(dá)是增加的（圖5e）。同樣，用PMap處理7天的初級(jí)單核細(xì)胞的潛伏增加了CD36的水平，但是這一時(shí)期似乎太短而不能改變CD68的表達(dá)（圖5e）。單核細(xì)胞誘發(fā)PMap分泌特性。穩(wěn)定的吞噬性單核細(xì)胞具有能夠分泌降解的基質(zhì)蛋白原和活性氧的能力。事實(shí)上，用PMap處理的THP-1細(xì)胞的孵化，但不是休眠期血小板，2-7天導(dǎo)致了功能性MMP9的產(chǎn)生，正如酶譜法所展示的那樣（圖6a）。酶譜法的量化表明在PMap孵育之后MMP活性隨時(shí)間而增加，7天之后用PMA孵育的效果是相似的（圖6b）。這次結(jié)果也表明MMP是由PMap衍生而來(lái)的而且血小板本身不可視的對(duì)上清液zymographic的活性的作用。此外，PMap的孵育明顯地增加了來(lái)自單核細(xì)胞（圖6c）和初級(jí)單核細(xì)胞（圖6d）H2O2的釋放。針對(duì)細(xì)胞激素和趨化因子分泌物的篩選，初級(jí)單核細(xì)胞用PMap或者休眠血小板培養(yǎng)44小時(shí)，隨后用半定量矩陣分析了細(xì)胞上清液細(xì)胞因子在平皿上的位置（圖7a）。明顯的是，與血小板相比較，PMap的出現(xiàn)刺激了幾個(gè)因子和其他因素的釋放，如C5a，CCL5和白細(xì)胞介素-23，和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子，可溶性CD40配基和可溶性細(xì)胞間粘附因子的小程度釋放。此外，單核細(xì)胞產(chǎn)生了幾個(gè)參與immunomodulating和regenerative過(guò)程的因素而不是炎癥，例如G-CSF和GM-CSF。用一種更多定量方式確定相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，我們做了C5a，GM-CSF，IFN-g和TNFa的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。盡管IFN-g的分泌水平低于檢測(cè)范圍，通過(guò)PMap，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定能夠最大限度的確定單核細(xì)胞C5a，GM-CSF和TNFa分泌的感應(yīng)，即使與PMap相比血小板能夠最大限度的增加GM-CSF的表達(dá)（圖7b）。討論在本文中，我們確定了PMap在單核細(xì)胞功能方面的強(qiáng)有力調(diào)節(jié)作用。這些微粒，在一個(gè)累死細(xì)胞凋亡的過(guò)程中由衰老血小板形成的，似乎顯示了一個(gè)特有的“不干粘合劑”膜表面，（GPllb/llla）附著激活的整合素和暴露磷脂酰絲氨酸，這可能會(huì)促進(jìn)單核細(xì)胞的相互作用與整合。在文獻(xiàn)中，血小板白血球coaggregate的形成被廣泛研究，例如，血小板激活的蛋白酶受體（凝血酶受體）和P2Y12受體的激活。非常少，但是，仍然被廣泛了解的是血小板微粒白細(xì)胞復(fù)合物的形成。本研究是首次證明血小板微粒的作用，白細(xì)胞產(chǎn)生的老化和凋亡的血小板的功能與分化。聯(lián)合我們的結(jié)果表明，與單核細(xì)胞和初級(jí)單核細(xì)胞相互作用的PMAP能夠喚起細(xì)胞極化和分化的潛能。在我們的應(yīng)用模型中血小板微粒和體外單核細(xì)胞的PMap，我們努力排除血小板在PMap混雜的長(zhǎng)期共培養(yǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的影響。事實(shí)上，由血小板自發(fā)產(chǎn)生的PMap被發(fā)現(xiàn)其功能是微乎其微的。精確地信號(hào)途徑，由PMap單核細(xì)胞觸發(fā)的途徑仍需要確定。一個(gè)可以想象的機(jī)制，支持我們的研究結(jié)果的是，引起通過(guò)趨化因子例如CCL5，保持和分泌活化的血小板和活化誘導(dǎo)的血小板微粒進(jìn)行的。這種機(jī)制解釋了PMap導(dǎo)致的單核細(xì)胞遷移的趨藥性和最近一直被暗示通過(guò)血小板的作用調(diào)控T細(xì)胞的分化。此外，PMap誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的激活可能依賴(lài)于微粒表面受體的特定分子之間的相互作用，包括血脂（磷脂酰絲氨酸），膠黏劑，激活受體（例如GPllb和llla受體）和GP反受體（P-選擇素）確認(rèn)為與血小板單核細(xì)胞活化相似。此外，在黏著作用下地PMap的內(nèi)吞作用可能迫使單核細(xì)胞進(jìn)入特異性的分化途徑。有趣的是，呈現(xiàn)出PMap誘發(fā)的單核細(xì)胞的粘附被青霉素廢除，暗示了磷酸肌醇-3-激酶信號(hào)通路在單核細(xì)胞活化中的作用（E.Vasina,未公布數(shù)據(jù)和巴里等）。循環(huán)的單核細(xì)胞呈現(xiàn)了一種不同子集的離散的性質(zhì)和功能。一個(gè)傳統(tǒng)的分工是“促炎”M1單核細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞毒作用，和“定居”M2單核細(xì)胞，參與組織重構(gòu)，傷口愈合及血管生成。M2單核細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)有力的endocytotic的活性分化為特定的專(zhuān)性吞噬細(xì)胞。得知定居單核細(xì)胞的形成是伴隨著CCR2的下調(diào)以及CCR5和CXCR4表面受體的上調(diào)，我們觀(guān)察到PMap分化為M2細(xì)胞和專(zhuān)性吞噬細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志性潛能。這點(diǎn)證實(shí)了膠黏劑整合表達(dá)的增加（CD11b），各自的低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白受體，CD68和CD36。和較高的氧化低密度脂蛋白的攝取。進(jìn)一步支持了這種概念，M2單核細(xì)胞優(yōu)先分化為樹(shù)突狀的細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)PMap刺激的單核細(xì)胞導(dǎo)致的GM-CSF數(shù)目的提高。目前的研究結(jié)果可能對(duì)我們理解動(dòng)脈粥樣硬化的病理有重要影響。初步支持在流動(dòng)狀態(tài)下PMap激活的單核細(xì)胞增強(qiáng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的附著力上，優(yōu)于血小板滲透，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段有關(guān)系。這增加的附著力可能是通過(guò)微粒上得受體介導(dǎo)的或者是通過(guò)粘合劑單核細(xì)胞受體的表達(dá)增加所致（例如，CD11b，CD31）以及可能是由于趨化因子表達(dá)擴(kuò)增所致例如CCL5。此外，單核細(xì)胞子集LyCloCCR2CCR5p被發(fā)現(xiàn)是使用CCL5受體CCR5當(dāng)進(jìn)入小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的時(shí)候，并且在幾項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)CCR5的阻塞導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的減少。類(lèi)似地，在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)PMap介導(dǎo)的CD14PCD16Pccr5Pcxcr4pp表型的人單核細(xì)胞的極化作用暗示形成了一個(gè)proatherogenic單核細(xì)胞子集，駐留在人類(lèi)的斑塊和加重了動(dòng)脈粥樣硬化。這項(xiàng)建議是支持這種觀(guān)察的，PMap激活單核細(xì)胞上調(diào)巨噬細(xì)胞標(biāo)記（CD14,CD36CD68）表達(dá)，并大量釋放MMP和H2O2,這些因素構(gòu)成了斑塊的不穩(wěn)定和最終的破裂，一個(gè)在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的臨床突發(fā)事件。早先的研究已經(jīng)表明，PMap的產(chǎn)生是在保存的血小板中的一個(gè)持續(xù)的過(guò)程，并且在血小板活化明顯缺乏的情況下。在流通的領(lǐng)域，像其他的凋亡小題，這些微粒將積極脫離約束力和吞噬?？梢韵胂?，這種去除白細(xì)胞，尤其是PMap介導(dǎo)的單核細(xì)胞的相互作用。事實(shí)上，血小板碎片和單核細(xì)胞的共集合，健康受試者血液中可檢測(cè)到。另一方面，這種相互作用可能有助于白細(xì)胞的長(zhǎng)期分化，正如我們?cè)诒疚闹兄赋龅哪菢?，甚至可以在駐地發(fā)展偏光因素的單核細(xì)胞。然而，進(jìn)一步的工作需要證明促PMap的單核細(xì)胞與M2細(xì)胞和體內(nèi)駐地巨噬細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞的不同。目前的結(jié)果表明，PMap具有調(diào)節(jié)免疫的潛能，由于刺激他們自己的食菌細(xì)胞的移除，如CD11b，CD1434和CD3625，所有的這些已經(jīng)被牽連在凋亡物質(zhì)的吸收上面了。這個(gè)建議被證實(shí)是由于促炎性和非炎性細(xì)胞因子的作用結(jié)果，包括G-CSF,GM-CSF和腫瘤壞死因子，這些是由PMap接觸單核細(xì)胞造成的?？傊@是首次研究證明，微粒自發(fā)地從細(xì)胞凋亡的血小板產(chǎn)生的，能促進(jìn)對(duì)駐地吞噬型的單核細(xì)胞，改變他們的行為和激活狀態(tài)，因此，提出一種新的機(jī)制，血小板和他們的產(chǎn)品可能影響動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)展。材料和方法單核細(xì)胞和初級(jí)單核細(xì)胞人類(lèi)急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)添加L谷氨酸和10%的胎牛血清（FBS）。MCs是從周邊血液的血沉棕黃層中獲得的，這些事從健康的知情器官捐獻(xiàn)者中提取的。單核細(xì)胞與中性粒白細(xì)胞中分離，采用密度梯度離心，進(jìn)一步選擇使用磁珠單核細(xì)胞分離試劑盒2,根據(jù)制造商的協(xié)議。單核細(xì)胞制備的純度是由基于對(duì)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析獲得的，純度達(dá)497%。血小板衍生微粒和洗滌血小板PMap是從血小板血漿中分離的，被儲(chǔ)存在標(biāo)準(zhǔn)血庫(kù)中5天。血小板被拆除，快速離心5分鐘4000Xg。血小板血漿制劑離心60分鐘20000Xg。含有PMap的微粒懸浮在PH7.45的HEPES緩沖液中，通過(guò)0.8毫米的過(guò)濾器過(guò)濾，以去除殘留的血小板，再次20000Xg40分鐘離心。上清液用于控制實(shí)驗(yàn)。用HEPES緩沖液再懸浮顆粒后，PMAP標(biāo)記的抗CD61-FITC單克隆抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。大小被估計(jì)，除了1和6毫米的熒光珠。CD61陽(yáng)性06毫米計(jì)算為PMap。PMap懸浮液直接使用或者冷凍在液氮中。分離的PMap實(shí)際上對(duì)于外切標(biāo)記CD63來(lái)說(shuō)是陰性的。正如所描述的那樣，血小板從新鮮的人體血液中分離出來(lái)。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記使用六十細(xì)胞儀上熒光激活細(xì)胞分選第二血小板和PMap表面熒光標(biāo)記蛋白水平CD61和CD62p抗體或者激活GPllb/llla受體。磷脂酰絲氨酸的表達(dá)，探討APC-膜聯(lián)蛋白A5、THP-1細(xì)胞或懸浮液中的細(xì)胞CD11b、CD31、CD14、CD16、CCR2、CCR5、CXCR4或者CD36。并如前所述準(zhǔn)備。使用流式細(xì)胞儀熒光激活細(xì)胞分選出第二血小板和PMap表面熒光標(biāo)記蛋白水平，示蹤細(xì)胞內(nèi)的CD68，并用多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.5%TRITON-X-100鼠抗CD68mAb染色。相對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照抗體是IgG1;IgG2b，k或者IgG2a和建議稀釋使用。表達(dá)水平被呈現(xiàn)熒光直方圖的等比中項(xiàng)，修正了與同型對(duì)照抗體相比較的值。單核細(xì)胞的粘附在含有5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中THP-1細(xì)胞的粘附被測(cè)量，如下所述。在37°C下，用工具，PMA，血小板或者PMap處理的細(xì)胞，被粘附在纖粘連蛋白表面。在指定的時(shí)間里，有活力的細(xì)胞被用BCECFacetoxymethylester處理一小時(shí)，然后測(cè)量所有細(xì)胞和粘連細(xì)胞的熒光性，使用SpectraFluoPlus讀取。念連代表了所有細(xì)胞熒光的百分比。孵化被一式三份。平行實(shí)驗(yàn)，示蹤細(xì)胞被刮掉，并通過(guò)校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，本質(zhì)上是相同的結(jié)果。原發(fā)性單核細(xì)胞粘附于人體主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞單核，在流動(dòng)條件下測(cè)定微觀(guān)視頻影像。在37C下細(xì)胞被孵育在HEPES緩沖液,PMap或者血小板中44h。期間灌注粘附單核細(xì)胞至少要算5個(gè)隨機(jī)微觀(guān)領(lǐng)域。碳酸脂膜細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)在5mm小孔的碳酸脂膜板上，底部會(huì)被媒介物，CCL2或者PMap充滿(mǎn)，或者與同型向控制或CCL5和CXCL7抑制性抗體在RPMI-1640培養(yǎng)基中。在含有5%的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中上氣室包含THP-1細(xì)胞。在經(jīng)過(guò)37C24h培育之后，在底部和上部的細(xì)胞被流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。檢測(cè)運(yùn)行三次。Transmigrated細(xì)胞的百分比被計(jì)算出來(lái)。在不同的孵化條件下，細(xì)胞總數(shù)保持不變。單核細(xì)胞功能分析在37C