基因的重組與轉(zhuǎn)移

基因的重組與轉(zhuǎn)移第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五外源DNA載體DNA重組分子原核細胞真核細胞擴增或表達表達連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細胞第五章

基因的重組與轉(zhuǎn)移

第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)

DNA片段的體外連接第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ligasenick第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成

“粘性末端”

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾—堿基互補第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五

第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五

第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五④缺點：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點：第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五（3）DNA接頭

(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。②adapter的作用第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點：連上后就能用。④缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護堿基）避免與所擴增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五引物1GCAGAATTC

互補序列模板EcoRI位點5’--3’

GCAGAATTC

互補序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補序列

PCR產(chǎn)物5’--3’

3’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五GCTAGCCGG

互補序列模板BamHI位點-5’

3-’

5’

復(fù)性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物

互補序列-5’

3’-引物2第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五帶酶切位點的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’

GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項插入片斷與載體的酶切位點互補相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’

3’

載體插入片斷第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五17第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五1.目的增加受體菌細胞膜的通透性。第二節(jié)

重組體導(dǎo)入細菌細胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細菌的過程。第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法

2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F

脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進入細菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細胞

（competentcells)第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細胞表面的DNA接受器位點（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進行擴增。第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后，在32℃下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個突變，所以細菌還不裂解。第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）

互補型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五(5)體外包裝過程

第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

轉(zhuǎn)導(dǎo)

第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補）；不育的菌株（不會與其他酵母接合）。第三節(jié)

外源基因?qū)胝婧思毎?、?dǎo)入酵母細胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五（1）利用原生質(zhì)球進行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細胞壁具有通透性，允許DNA進入。CaCl2使細胞膜具有通透性，允許DNA進入。

轉(zhuǎn)化第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)