發(fā)酵液的預(yù)處理細(xì)胞破碎與固液分離

發(fā)酵液的預(yù)處理細(xì)胞破碎與固液分離第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五待處理雜質(zhì)的影響金屬離子粘稠物蛋白質(zhì)第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.1.1.1發(fā)酵液雜質(zhì)的去除1.無機(jī)離子的去除(首先考慮：離子交換法)Ca2+Mg2+Fe2+草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+

黃血鹽，→普魯士藍(lán)沉淀Fe3+赤血鹽，→滕氏藍(lán)沉淀3Fe2++2K3Fe(CN)6→Fe3[Fe(CN)6]2↓+6K+

第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.蛋白質(zhì)的去除（1）Savage去除蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)處于兩相之間）正丁醇：氯仿=1：4（5）該法條件溫和，可避免多糖的降解，但除蛋白質(zhì)效率低。（2）三氯乙酸去除蛋白質(zhì)向多糖溶液加入1/5體積10%的三氯乙酸溶液磁力攪拌30

min，離心去除沉淀。缺點是易引起某些多糖的降解。在280nm出測定光吸收值（3）蛋白質(zhì)酶去除蛋白質(zhì)

第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.1.1.2改善培養(yǎng)液的性能（1）加熱法除去某些熱敏性雜蛋白，降低黏度，有利過濾（如糖液熱過濾）。取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性、能耗。一般加熱65-80℃。（2）調(diào)節(jié)pH值第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五（3）凝聚和絮凝凝聚：中和電荷，通常細(xì)菌的表面都帶有負(fù)電荷工業(yè)上常用陽離子型。無機(jī)鹽類：Al2(SO4)3，KAl(SO4)2?18H2O,Fe2(SO4)3，F(xiàn)eSO4，ZnSO4,AlCl3,ZnCl2金屬氫氧化物或氧化物：

Fe(OH)3,Al(OH)3,Ca(OH)2；CaO等高價金屬。第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

絮凝絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如—COOH）或陽離子（如—NH2）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五絮凝劑種類陰離子型陽離子型非離子型聚丙烯酸鈉（無毒，食品醫(yī)藥可用）和聚苯乙烯磺酸聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二丙基四胺鹽聚氧化乙烯第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAM）是目前工業(yè)應(yīng)用最廣泛的高分子絮凝劑之一。陰、陽、兩性、非離子型：分別用陰、陽、非離子單體和丙烯酰胺共聚而成的線形離分子聚合物。優(yōu)點：種類多，用量少，ppm級，絮凝體粗大，效果好，速度快。缺點：聚丙烯酰胺本身無毒，但是其單體有毒。

特別是陽離子型，食品醫(yī)藥謹(jǐn)用。第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五食品和醫(yī)藥工業(yè)常用絮凝劑陰離子型：聚丙烯酸鈉（無毒，食品醫(yī)藥可用）和聚苯乙烯磺酸；無機(jī)高分子聚合物絮凝劑：聚合鋁鹽、聚合鐵鹽；天然有機(jī)高分子絮凝劑：丹寧，明膠，殼聚糖。第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五聚合氯化鐵第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.1.2

發(fā)酵液的固液分離

重力沉降浮選雙水相萃取微孔過濾：固液相分離不完全，濃縮液中

70-80%水（常規(guī)過濾固相含水30-40%）工業(yè)上常用過濾離心第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.1.2.1

過濾

（1）影響過濾速度的因素菌種發(fā)酵條件第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五真菌細(xì)菌放線菌第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五菌種對過濾的影響

：菌絲粗，易過濾，不需特殊處理，可用真空轉(zhuǎn)筒過濾機(jī)。如青霉菌的菌絲直徑可達(dá)10μm。：菌絲細(xì)而分支，交織成網(wǎng)絡(luò)狀，過濾困難，一般須預(yù)處理。鏈霉素菌絲：0.5-1.0μm。（抗生素約70%是放線菌產(chǎn)生）：菌體更細(xì)小，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預(yù)處理，很難用過濾和分離法操作。0.5~5μm真菌放線菌細(xì)菌第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五過濾助劑過濾助劑可解決兩個問題濾餅的可壓縮性問題小粒子如菌絲碎片和細(xì)菌細(xì)胞，會滲入到轉(zhuǎn)鼓真空過濾預(yù)覆蓋層內(nèi)部，堵塞部分孔。常用的過濾助劑

硅藻土、珍珠巖、活性白土第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五助濾劑兩種加入方法預(yù)先鋪一層助濾劑(1~2mm)助濾劑用量等于懸浮液中固體含量第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五（2）過濾設(shè)備板框過濾機(jī)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)加壓葉濾機(jī)帶式過濾機(jī)袋式過濾機(jī)第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五板框過濾機(jī)第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五板框過濾機(jī)優(yōu)點板框壓濾機(jī)的過濾面積大；過濾推動力(壓力差)能較大幅度地進(jìn)行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差；結(jié)構(gòu)簡單，價格低；動力消耗少等優(yōu)點。缺點不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強(qiáng)度大；衛(wèi)生條件差；非生產(chǎn)的輔助時間長，阻礙了過濾效率的提高。第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)優(yōu)點：能連續(xù)操作，能實現(xiàn)自動化控制缺點：壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過濾。第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五帶式壓濾機(jī)第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五PBF系列連續(xù)水平真空帶式過濾機(jī)

緊湊帶式過濾機(jī)第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五加壓葉濾機(jī)（立式）適合于固體含量少于0.1%第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.1.2.2離心優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好，操作時衛(wèi)生條件好；缺點：設(shè)備投資高、能耗大。第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五項目低速離心機(jī)高速離心機(jī)超離心機(jī)轉(zhuǎn)速（r/min)2000-600010000-2600030000-12000離心力（g）2000-70008000-800000100000-600000細(xì)胞細(xì)胞核細(xì)胞器蛋白質(zhì)表2.3離心機(jī)的種類和適用范圍第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五離心力計算離心轉(zhuǎn)速r=5000

r/min，半徑R=30

cm，離心力？gZg=8385gZ=1.118×10-5×(r)2×R第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五超離心法

分為：差速離心，區(qū)帶離心。差速離心(differentialcentrifugation)

主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五區(qū)帶離心（Zonalcentrifugation）

密度梯度制作：先調(diào)配不同濃度（密度）的蔗糖溶液，然后在離心管中以濃度從大到小層層加入即可。將一定濃度的蔗糖溶液經(jīng)一定時間的高速離心后可制成連續(xù)的蔗糖密度梯度。CsCl和NaBr在離心力的作用下可自動形成密度梯度。第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五三足式離心機(jī)第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五碟片式離心機(jī)第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五管式離心機(jī)第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.2細(xì)胞破碎

胞內(nèi)產(chǎn)物：胞內(nèi)酶（青霉素?；?，堿性磷酸酯酶），脂類，甾族化合物（萃取法提取），遺傳工程菌生產(chǎn)的蛋白質(zhì)及某些抗生素。第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五圖2.8真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞壁葉綠體高爾基體線粒體核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核細(xì)胞膜2.2.1細(xì)胞的結(jié)構(gòu)動物、植物和微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)相差很大。第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五生物細(xì)胞

類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(幾丁質(zhì))(80-90%)脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁（纖維素，半纖維素，木質(zhì)素）第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五圖2.9細(xì)胞破碎機(jī)理第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.2.3細(xì)胞破碎技術(shù)2.2.3.1機(jī)械破碎高壓勻漿器球磨機(jī)超聲波破碎非機(jī)械方法：輔助方法2.2.3.2化學(xué)和生物化學(xué)滲透（1）酸堿處理；（2）化學(xué)試劑處理；（3）酶溶2.2.3.3物理滲透法（1）滲透壓沖擊；（2）凍結(jié)-融化法工業(yè)上常用實驗室常用第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.2.3.1機(jī)械破碎（1）高壓勻漿法細(xì)胞懸浮液細(xì)胞勻漿液碰撞環(huán)圖2.11高壓勻漿器結(jié)構(gòu)簡圖閥閥座第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五破碎原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速（可達(dá)450m/s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。操作壓力通常為50-70MPa。第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五團(tuán)狀或絲狀真菌：堵塞較小的革蘭氏陽性菌：太小含有包含體的基因工程菌：太堅硬不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五（2）球磨法球磨機(jī)研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠或氧化鋯一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。微珠填充率是細(xì)胞的80-85%，微珠與目標(biāo)細(xì)胞的直徑比30-100之間。第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五細(xì)胞懸浮液微珠冷卻劑冷卻劑細(xì)胞勻漿液攪拌槳液珠分離器圖2.13珠磨機(jī)結(jié)構(gòu)簡圖第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五玻璃珠氧化鋯第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五膠體磨第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五德國進(jìn)口珠磨機(jī)（立式）高速組織搗碎機(jī)第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。

特點

超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。該法在實驗室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。（3）超聲波法第四十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五超聲波破碎儀第四十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第五十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.2.3.2化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸堿處理可以使蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來?；瘜W(xué)試劑處理

表面活性劑：十二烷基磺酸鈉（SDS)，TritonX-100,十四烷基胺鹽(CTAB);

螯合劑：乙二胺四乙酸（EDTA），與金屬離子結(jié)合，如陰性菌外層Mg2+、Ca2+處理的方法;

有機(jī)溶劑:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。第五十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五酶溶法

利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壁的目的。優(yōu)點：專一性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點：酶水解費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實驗室研究。第五十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

（1）細(xì)菌：溶菌酶lysozyme

革蘭氏陽性菌：溶菌酶革蘭氏陰性菌：溶菌酶+EDTA（破壞脂多糖）（2）酵母：Zymolyase，葡聚糖酶或甘露糖酶（3）植物細(xì)胞壁：纖維素酶可將化學(xué)法與機(jī)械法結(jié)合起來。溶菌酶、多糖水解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿法處理6次，破碎率95%以上。第五十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五另一種酶解方法，溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過程的因素有溫度、時