單基因遺傳病的分子生物學檢驗-醫(yī)學院課件

單基因遺傳病的分子生物學檢驗

MolecularDiagnosisforMonogenicInheritedDiseasesDNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄

翻譯

核酸的分子雜交

基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_異常PCR

DNA測序

Nothern-blot

實時熒光定量PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR

蛋白質(zhì)芯片

ELISA

蛋白組織化學染色Western-blot基因芯片

分子生物學檢驗的技術和方法Southern-blot

遺傳病的分類單基因遺傳病多基因遺傳病體細胞遺傳病線粒體遺傳病染色體病

一、單基因遺傳病分子生物學檢驗技術與策略導致單基因病產(chǎn)生的基因突變類型

基因突變點突變密碼子插入和缺失外顯子缺失或重復基因倒位基因融合動態(tài)突變動態(tài)性突變

以三核苷酸為單位的重復序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。脆性X綜合征：CGG重復。少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復。

……致病基因：能導致遺傳病或與遺傳病發(fā)生相關的基因。致病基因的遺傳方式：單基因遺傳和多基因遺傳。單基因遺傳?。喊l(fā)病涉及到一對等位基因，符合孟德爾遺傳。單基因遺傳方式常染色體遺傳性染色體遺傳常染色體顯性遺傳常染色體隱性遺傳X連鎖遺傳Y連鎖遺傳二、單基因遺傳病的分子生物學檢驗常用技術（一）等位基因特異性PCR（AlleleSpecific-PCR,AS-PCR）（二）限制性酶譜分析（restrictionmap

）

限制性核酸內(nèi)切酶在DNA序列上有特異的識別和切割位點，當基因突變涉及該識別位點改變時，可通過酶切后的電泳分離，根據(jù)酶切片段長度及數(shù)目判定突變有無發(fā)生。（三）PCR-反向斑點雜交（PCR-reversedotblot，PCR-RDB）

將多個特異性探針固定于固相支持物，再將經(jīng)PCR特異擴增的待測產(chǎn)物與之雜交。中間引物為突變引物（M）時，M只能退火結(jié)合于具有具有突變的等位基因上，阻礙了同方向正常引物（U）的延伸，故只能獲得突變引物（M）與反向正常引物（D）所引導的較短擴增片段。(四)突變寡核苷酸延伸擴增（mutantoligonucleotideextensionamplification，MOEA）（五）裂口PCR（gap-PCR）跨越斷裂點PCR，該法是在斷裂點即缺失序列上下游分別設計特異引物，正常情況下（不存在缺失），由于正、反引物間DNA過長無法擴增；而當片段缺失時，正、反引物彼此靠近，可在一定條件下擴增出特異條帶。因此，根據(jù)條帶的存在判斷是否存在缺失。三、單基因遺傳病的分子生物學檢驗策略直接診斷策略間接診斷策略直接診斷策略前提：被檢測的致病基因的正常結(jié)構(gòu)和序列已經(jīng)被闡明目的：檢測DNA中的點突變、缺失、插入、倒位、重復或重排策略：靜態(tài)突變：突變能穩(wěn)定遺傳，主要基因突變形式。

動態(tài)突變：突變DNA在遺傳過程中進一步突變。

直接診斷常用的檢測方法點突變：核酸雜交、AS-PCR、PCR-RFLP、基因芯片；PCR-SSCP、DGGE、DNA-Seq。片段突變：Southernblot、多重PCR、熒光原位雜交等。動態(tài)突變的檢測：

Southernblot、PCR、DNA測序等技術。例如：脆性X染色體綜合征（智力低下）間接診斷策略連鎖分析：通過覆蓋密度適當?shù)倪z傳標記在患病家系中進行連鎖分析，找到與某一遺傳標記緊密連鎖的致病基因座，從而確定該基因在染色體上的粗略位置。關聯(lián)分析：在可能的候致病基因附近選擇遺傳標記，并在患者和正常個體之間比較，從而得到某一等位基因片段與致病基因關聯(lián)的相對危險度。由于間接診斷是通過遺傳標記的多態(tài)性分析染色體單倍型是否與致病基因連鎖，從而判斷被檢者患病風險以及是否為治病基因攜帶者，因為間接診斷實際上也是患病風險的評估。遺傳標記的選擇是進行間接診斷的前提，也是獲得準確診斷結(jié)論的保證。在選擇遺傳標記時，首先應該選擇致病基因內(nèi)部的標記，如果致病基因小，編碼區(qū)內(nèi)沒有合適的遺傳標記，則選擇致病基因周圍非編碼區(qū)，選擇最近的遺傳標記。產(chǎn)前診斷方法四、產(chǎn)前診斷非創(chuàng)傷性超聲波檢查母體外周血血清標志物胎兒細胞檢測創(chuàng)傷性胎兒鏡羊水穿刺胚胎活檢1、血紅蛋白病2、血友病3、脆性X綜合征4、家族性高膽固醇血癥第二節(jié)血紅蛋白病的分子生物學檢驗血紅蛋白病是指由于編碼血紅蛋白的基因異常而發(fā)生的一類遺傳性貧血。一類是珠蛋白分子結(jié)構(gòu)的異常，如鐮刀細胞貧血等。一類是珠蛋白生成障礙性貧血，也叫地中海貧血，主要是由于珠蛋白多肽鏈的合成速率不平衡所致。一、珠蛋白基因簇的結(jié)構(gòu)特征分類：α珠蛋白基因簇

ζ基因α基因β珠蛋白基因簇ε基因γ基因δ基因β基因位置：

α珠蛋白基因簇:16p13.33

β珠蛋白基因簇:11p15.5＊α珠蛋白基因簇包括一個ζ基因、3個假基因(ψζ、ψα1、ψα2)、α2、α1

＊β珠蛋白基因簇包括ε、γ(Gγ、Aγ)、ψβ、δ、β不同階段的血紅蛋白基因表達和血紅蛋白組成六種正常血紅蛋白的肽鏈組成和正常人血中的濃度

血紅蛋白種類

肽鏈組成

(分子式)

正常成人血中

的濃度（%）

HbA(A1)

α2β2

95～98

HbA2

α2δ2

2～3

HbF

α2γ2～1(胎兒期)

Gower1

ζ2ε2無（胎兒期早期）

Gower2

α2ε2無（胎兒期早期）

Portland

ζ2γ2無（胎兒期早期）二、異常血紅蛋白病血紅蛋白?。菏怯捎诰幋a血紅蛋白的基因突變導致珠蛋白生成異常所引起的疾病。臨床上常見四種：鐮刀型細胞貧血（血紅蛋白S?。环€(wěn)定血紅蛋白病，氧親和力增高血紅蛋白，血紅蛋白M（家族性紫紺癥）(一)鐮刀形紅細胞貧血及分子機制概念：由于β珠蛋白基因錯義突變引起的溶血性貧血，屬于常染色體隱性遺傳病。鐮刀形紅細胞貧血癥是第一個被揭示的“分子病”。鐮刀型貧血癥是一種遺傳性貧血癥，屬隱性遺傳性疾病?；颊叩募t細胞缺氧時變成鐮刀形，失去輸氧的功能，破裂造成嚴重貧血。鐮刀形紅細胞貧血癥的分子基礎例1、鐮形細胞貧血病(HbS)

β基因第6位密碼子GAG→GTGmRNA密碼子GAG→GUG

蛋白質(zhì)氨基酸谷氨酸→纈氨酸例2、血紅蛋白C病(HbC)

β基因第6位密碼子GAG→AAGmRNA密碼子GAG→UUG

蛋白質(zhì)氨基酸谷氨酸→賴氨酸鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)血紅蛋白C病N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbCβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·lys·glu·····C(146)機理：HbC的氧親和力下降，氧化后結(jié)晶，紅細胞僵硬，不能進行微循環(huán)，丟掉部分細胞膜而使紅細胞變成小球形紅細胞，其變形能力差，容易被單核吞噬細胞破壞發(fā)生溶血。(二)鐮狀細胞貧血的分子生物學檢驗原因：β珠蛋白基因發(fā)生點突變檢驗策略：限制性酶譜分析（RE）：最常用ASO探針雜交：AS-PCR等

某一限制酶識別位點移位的大片段缺失或插入，某一限制酶識別位點喪失或獲得的點突變，均可引起相應限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。

×MstⅡ酶切位點(CCTNAGG)5′3′正?；蛲蛔兓?.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析0.2kb1.15kb5′3′+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切電泳分析受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產(chǎn)物與標記的ASO探針雜交主要適用于檢測已知點突變ASO1ASO2βA

βsβs

βsASO探針雜交βA

βA（三）分子生物學檢驗的臨床意義鐮刀狀細胞貧血的分子生物學檢驗針對發(fā)生突變的β珠蛋白基因開展，采用直接診斷策略，直接判斷突變類型，區(qū)分出雜合子和純合子，也可發(fā)現(xiàn)新的突變類型，也可用于鐮刀狀細胞貧血的早期診斷及產(chǎn)前診斷。三、珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血：是由于珠蛋白鏈合成速率降低，引起α鏈和非α鏈數(shù)量不平衡造成的單基因遺傳病。主要是：珠蛋白生成障礙性貧血（地中海貧血）

根據(jù)缺乏的珠蛋白鏈的種類及缺乏程度命名分類為：α、β、δ、γ、δβ、γδβ六種類型分布最廣和最嚴重的是α和β生成障礙性貧血（一）α珠蛋白生成障礙性貧血及其分子機制Normal:

α2β2名稱基因型描述基因型Α珠蛋白鏈的合成量臨床癥狀靜止型α珠蛋白生成障礙性貧血αA/α+αα/α-75%基本無癥狀標準型α珠蛋白生成障礙性貧血α+/α+α-/α-50%輕度貧血HbH病α+/α0α-/--25%代償性溶血性貧血胎兒水腫綜合征α0/α0--/--0死胎、新生兒死亡

α地中海貧血：不同數(shù)量(1-4個)α珠蛋白基因缺失分子機制：1.基因缺失：細胞減數(shù)分裂時α珠蛋白基因發(fā)生不等位交換點突變：α2中CTG突變?yōu)镃CG,使得Leu被Pro取代。移碼突變：α1珠蛋白基因中第14個密碼子中一個核苷酸缺失。無義突變：α1珠蛋白基因中某個密碼子變成終止密碼子。mRNA加尾信號突變：突變發(fā)生在α2珠蛋白基因的3’端高度保守序列，致使無法進行加尾。終止密碼子突變：α1珠蛋白鏈中氨基酸數(shù)目增加，穩(wěn)定性下降。2.基因突變：（二）α珠蛋白生成障礙性貧血的分子生物學檢驗主要是由于α珠蛋白基因缺失，PCR是首選的檢驗策略；大范圍缺失的檢測主要是Southern雜交技術；針對非缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血，可用SSCP、AS-PCR等；通過對絨毛膜細胞或羊水細胞、胚胎臍血進行DNA檢測，可進行產(chǎn)前診斷,可防止純合子患兒的出生。主要的檢驗策略包括：α地貧的基因診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1~4個。正?；蚪M用BamH1切割，可得到14kb的片段，而缺失一個α基因時得到10kb片段。1.PCR法

擴增片段產(chǎn)物不同可檢出不同類型的α珠蛋白生成障礙性貧血。鑒別缺失的首選方法。

2.Southern印跡法

α地中海貧血的基因簇限制性酶切片段長度

α基因探針

ζ基因探針

BamHⅠEcoRⅠHindⅢEcoRⅠaa/aa142316.5，1323，5

--/----

20，1317，5

a3.7-/aa10.319.3NDNDa4.2-/aa9.818.8NDND493.AS-PCR

非缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血的分子診斷和產(chǎn)前診斷。4.SSCP

非缺失型α2珠蛋白基因突變篩查，DNA在非變性PAGE電泳體系中的構(gòu)象來鑒定DNA序列改變的一項技術。5.gap-PCR

通過PCR擴增產(chǎn)物帶出現(xiàn)差異，可區(qū)分正常基因型和缺失型。（三）β珠蛋白生成障礙性貧血及其分子機制β珠蛋白生成障礙性貧血是由于β珠蛋白基因功能下降或缺失所致的一類遺傳性溶血性疾病。點突變是該疾病的主要發(fā)病原因：發(fā)生在啟動子區(qū)域

mRNA水平下降發(fā)生在剪接信號及附近區(qū)域異常mRNA不穩(wěn)定發(fā)生在ORF影響β珠蛋白合成β地中海貧血常見突變位點（四）β珠蛋白生成障礙性貧血的分子生物學檢驗PCR-RDBPCR-ASOAS-PCR基因芯片MOEA（突變寡核苷酸延伸擴增）主要是點突變或移碼突變，已發(fā)現(xiàn)170多種的核苷酸取代突變，PCR及點突變檢測技術是主要技術。1.PCR-RDB缺點：僅能檢測已知的點突變2.PCR-ASO當基因的突變情況完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（ASO），長度通常為20bp左右。一種探針與正?；螂s交，另一種探針與突變基因雜交，即將突變的基因區(qū)別開來。

PCR先將含有突變點的基因進行擴增，然后再與ASO探針作點雜交。優(yōu)點是靈敏、準確，缺點是一次雜交只能檢測一種突變。

AAATAAAGGC

產(chǎn)物

AAAAAAAGGC

產(chǎn)物TTTTTTTTTTATTT正常引物突變引物PCRPCR無突變突變雜合子3.AS-PCR574.基因芯片設計多個基因突變位點，采用PCR-RDB，一次性檢測出樣本中多個基因位點突變。5.MOEA（突變寡核苷酸延伸擴增）RT-PCRIVS-ⅠIVS-ⅡIVS-ⅠIVS-ⅡIVS-Ⅰ579654β

globingenemRNA(N)mRNA(M)ABC第三節(jié)血友病的分子生物學檢驗

血友病是一種遺傳性出血性疾病。發(fā)病原因是由于患者的血液中由于基因缺陷先天缺乏某種凝血因子，根據(jù)缺乏因子的的不同分為三種類型:血友病甲(缺乏凝血因子Ⅷ,又稱血友病A)、血友病乙（缺乏凝血因子Ⅸ，又稱血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子XI）。血友病A和B均屬X性隱性遺傳，一般由女性傳遞，男性發(fā)病。血友病丙較少見，為常染色體不完全隱性遺傳，男女均可發(fā)病，通常所說的血友病是指的血友病甲。一、血友病及凝血因子基因

甲型血友?。ㄑ巡）發(fā)病的分子機制是FVⅢ基因突變，F(xiàn)VⅢ基因位于X染色體長臂末端（Xq28），包括26個外顯子和25個內(nèi)含子，全長186kb。遺傳方式：X隱形遺傳

突變主要為點突變或少數(shù)堿基的缺失和插入以及第22內(nèi)含子的大片段倒位。

第22號內(nèi)含子倒位的機制A3為遠端重組，A2為近端重組

到1994年已報道的FVⅢ基因點突變174種，缺失117種，插入10種。由于導致病變的點突變多，在實際工作中不可能對每一對病人作點突變的檢測，所以DNA多態(tài)性的連鎖分析仍然是檢測此疾病的常用手段。乙型血友病（血友病B）：其分子機制是分布于整個FⅨ基因各處的多種形式的突變。女性攜帶正常A1倒位（一）直接檢驗策略：LD-PCR（檢驗基因倒位）二、血友病A的分子生物學檢驗一個等位基因點突變是非倒位引起血友病A的主要原因，但FVⅢ基因突變無熱點。

遺傳標記檢測都結(jié)合PCR技術，經(jīng)過PCR擴增后再檢測這些擴增片段的長度，即可了解被檢樣本的基因型，從而判斷是否與致病基因連鎖。（二）間接診斷策略：RFLP/STR/VNTR18內(nèi)含子+連鎖BCL1酶切位點是正常的突變基因A型血友病的分子診斷－PCR-RFLP連鎖分析法A/B/CB/CC/DC/B/DPCR檢測VNTR（st14DXS52）位點進行家系連鎖分析位于Xq28，與FVⅢ緊密連鎖兩者相距2cm血友病B，又稱Christmas病或血漿凝血酶成分缺乏，發(fā)病原因為編碼FⅨ基因缺陷，導致含量缺乏或結(jié)構(gòu)異常，從而使凝血功能障礙。FⅨ基因突變的種類繁多，700多種，具有十分顯著的異質(zhì)性，幾乎每個家系都有其特異基因突變類型，再則FⅨ基因較小，因此給分子診斷帶來一定困難。三、血友病B的分子生物學檢驗Southern印跡雜交DNA測序基因芯片毛細管電泳直接檢驗方法：RFLPSSCPDGGE法雙脫氧指紋圖譜變性高效液相色譜法間接檢驗方法：第四節(jié)脆性X綜合征的分子生物學檢驗脆性X綜合征（fragileXsyndrome,FraX）,常見的X連鎖隱性遺傳病，主發(fā)于男性，發(fā)病率為1/3500個新生嬰兒。男性發(fā)病率1/1000-1/1500，智力低下10%-20%，大睪丸、長臉、大頭、大耳、前額突出，下頜大而前突，嘴大唇厚發(fā)音障礙。

脆性位點是染色體上在特殊條件下易斷裂的位點，可能為收縮或縫隙。在人類染色體上已發(fā)現(xiàn)一系列的脆性位點。其中研究最詳盡的位于X染色體上，目前發(fā)現(xiàn)其與智障有關。脆性X綜合癥為X連鎖遺傳，出現(xiàn)幾率在男嬰中為1/2500，主要原因可能是因為CGG三核苷片段重復數(shù)目的變化。RNA結(jié)合蛋白脆性X綜合征發(fā)病機制，是(fragileXmentalretardation,FMR-1脆性X智力低下1號)基因5’-UTR區(qū)有數(shù)目可變的（CGG）n三核苷酸重復，上游250bp存在CpG島。（一）FMR-1基因5’端（CGG）重復序列異常擴增73（二）FMR-1基因5’端CpG島的異常甲基化（三）FMR-1基因缺失基因啟動子區(qū)域缺失660bp或25kb的DNA片段。（四）FMR-1基因點突變二、脆性X綜合癥的分子生物學檢驗（一）Southern印記雜交:根據(jù)待測樣本CpG島異常甲基化，選擇甲基化敏感的DNA限制酶對DNA片段進行酶解，再設計針對突變位點的探針進行雜交，確認全突變和前突變。

12345678910111212男、女性對照，3男性前突變，4女性前突變（攜帶者），5全突變，6女性發(fā)病7男性對照，8女性對照，9男性前突變，10女性前突變，11男性發(fā)病，12女性發(fā)?。ǘ㏄CR：根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小計算CGG重復拷貝而對異常擴增做出判斷，大于200的CGG全突變不能呈現(xiàn)有效擴增，則再進行Southernblot。（三）微衛(wèi)星序列分析：FMR-1基因兩側(cè)有三個連鎖遺傳標記（FraXAC1、FraXAC2、DXS548），采用PCR擴增中間標記基因分雜合率。第十四

章

染色體疾病的分子生物學檢驗第一節(jié)染色體異常與疾病1.染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)2.染色體的數(shù)目異常與疾病3.染色體的結(jié)構(gòu)異常與疾病一、染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)體細胞46條常染色體（22對,44條）性染色體（1對,2條）女：XX男：XY生殖細胞23條卵細胞（22+X）精細胞(22+X)或(22+Y)

染色體組：人體正常生殖細胞精子和卵子都含有23條染色體，為一個染色體組。

紡錘絲

主縊痕

次縊痕染色質(zhì)

染色單體

核粒

DNA雙螺旋

微管染色質(zhì)纖絲折疊蛋白DNA蛋白質(zhì)(組蛋白)螺旋體超螺旋體著絲粒和紡錘體微管的連接部位DNA:1.74米細胞核:5微米

短臂隨體著絲粒長臂

中央著絲粒染色體亞中著絲粒染色體近端著絲粒染色體人類中期染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)Metacentric(1,3,16,19,20)Submetacentric(2,4-12,17,18,X)Acrocentric(13,14,15,21,22,Y)核型及分組核型（Karyotype）：指將一個細胞內(nèi)的全部染色體按照一定的順序排列起來所構(gòu)成的圖像。核型分析（Karyotypeanalysis）：對核型進行數(shù)目、形態(tài)特征分析，以確定是正常還是異常核型。

染色體異常是指染色體數(shù)目的增減或結(jié)構(gòu)的改變，故分為數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類。染色體病是由于體內(nèi)、外因素導致的先天性染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)畸變而引起的疾病。臨床上多表現(xiàn)為一組綜合征。

以二倍體為標準，如果體細胞染色體數(shù)目超出或少于46條，稱為染色體數(shù)目畸變。包括整倍性異常和非整倍性異常。二、染色體的數(shù)目異常與疾?。ㄒ唬┒啾扼w和整倍體體細胞的染色體不是由兩個染色體組，而是三個、四個染色體組組成時，稱多倍體。

1.三倍體：其細胞中有三個染色體組（3n=69）,是流產(chǎn)的重要原因之一，極少數(shù)存活。

產(chǎn)生原因：為雙精子或雙雌受精受精。23X23Y23Y69XYY69XXY23X23X23Y2.四倍體：含四個染色體組（4n=92）,全身性,更罕見，一般在流產(chǎn)胚胎，或者伴有多發(fā)畸形。產(chǎn)生原因：核內(nèi)有絲分裂:因紡錘體的缺陷，細胞不能分裂所致核內(nèi)復制:分裂前復制兩次。體細胞中的染色體數(shù)不是染色體組的整倍數(shù)，而是比二倍體少或多一條或幾條染色體，如亞二倍體（單體型），超二倍體（三體型）。

單體型（monosomy）某號染色體比正常減少一條，常染色體單體型是致死性的。臨床上常見X染色體單體型，表現(xiàn)為Turner綜合征。

三體型（trisomy）：某號染色體比正常增多一條。除部分三體型外，三體型多導致流產(chǎn)，但它是最常見的染色體數(shù)目異常類型。常見病Down綜合征，Klinefelter綜合征（二）異倍體或非整倍體臨床上最常見的染色體異常引起染色體異常的因素：輻射誘變疾病影響藥物損傷發(fā)育異常環(huán)境因素醫(yī)療措施三、染色體結(jié)構(gòu)異常與疾病

非整倍體形成原因染色體不分離（nondisjunction）

有絲分裂不分離減數(shù)分裂不分離染色體丟失（chromosomeloss）染色體不分離：指某一對同源染色體或兩條染色單體在分裂的后期不能正常分開，而同時進入某一子細胞，導致形成的子細胞中，一為超二倍體，另一為亞二倍體，這一過程稱染色體不分離。

染色體丟失：分裂后期染色單體的滯留導致染色體減少。減數(shù)分裂I不分離正常減數(shù)I分離減數(shù)分裂不分離減數(shù)分裂II不分離正常減數(shù)II分離（一）染色體結(jié)構(gòu)異常的類型

缺失（deletion，del）

環(huán)狀染色體（ringchromosome,r）

等臂染色體（isochromosome,i）

倒位（inversion,inv）

易位（translocation,t）

重復（duplication,dup）

染色體結(jié)構(gòu)的發(fā)生異常改變，稱為染色體結(jié)構(gòu)異常或染色體畸變。12345671234567重復（duplication,dup）

1234567123456712345675123467常見三種：（1）相互易位（reciprocaltranslocation）:兩條非同源染色體同時發(fā)生斷裂，其斷片相互交換位置后重接，形成兩條新的衍生染色體。易位（translocation）：兩條非同源染色體同時發(fā)生斷裂，兩斷片互換位置重新連接的現(xiàn)象

（2）羅伯遜易位（Robertsoniantranslocation）:又稱著絲粒融合，指近端著絲粒染色體在著絲粒處融合的易位。RAB1234567RAB1234567B567（3）插入易位（insertionaltranslocation）:是指兩條非同源染色體同時發(fā)生斷裂，其中一條染色體的斷裂片段插入到插入到另一染色體的非末端部位。（5）等臂染色體（6）環(huán)狀染色體(二)染色體結(jié)構(gòu)異常與疾病21三體綜合征（Down綜合征、先天愚型）1.三大特征:高嚴重智力地下、50%伴有先心、大多有皮紋改變2.其他表現(xiàn)：新生兒中1/800～1/600，隨母親年齡增加發(fā)病率提生長發(fā)育遲緩，智力低下，具有特殊的呆滯面容，伸舌有時流涎，又稱伸舌樣癡呆，男性不育、女性偶有生育能力。

3.類型及形成機制：1)完全型型（約占92.5%）：

47，XX（XY），+21原因：95%為母親形成卵子時，發(fā)生21號染色體不分離，導致異常卵子（24，X，+21）與正常精子結(jié)合而成。發(fā)病率隨母親年齡增高而增大

46，XX（XY）/47，XX（XY），+21原因：受精卵卵裂時發(fā)生21號染色體不分離，形成嵌合體。３）易位型（約占5%）：常見14/21易位

46，XX（XY），-14，+t（14q；21q)原因：45%是由平衡易位攜帶者遺傳而得。55%為新發(fā)生的。２）嵌合型（約占2%）：人類的14/21染色體羅伯遜易位型21三體2114q/21qTurner綜合征（又稱先天性卵巢發(fā)育不全綜合征）發(fā)病原因：全部或部分體細胞中的一條X染色體部分或完全缺失所致。臨床表現(xiàn)：身材矮小(120m-140m)，性發(fā)育幼稚,外生殖器和乳房幼稚型，乳間距寬，性腺為纖維條索狀，無濾泡，子宮、不育。肘外翻，上眼瞼下垂，后發(fā)際低，50%有蹼頸，皮膚色素增多。智力正常或輕度障礙。常見核型：X單體型45，X占55%左右產(chǎn)生原因:父親或母親形成生殖細胞時,發(fā)生性染色體不分離，導致異常生殖細胞受精所致。嵌合型

45，X/46,XX;45,X/47,XXX等。約占25%，易存活，癥狀較輕產(chǎn)生原因:受精卵卵裂時發(fā)生后期遲滯,X染色體丟失,形成嵌合體。X染色體短臂或長臂缺失

46,X,del(Xp)或46,X,del(Xq)X染色體長臂或X短臂等臂

46,X,i(Xq)或46,X,i(Xp)5p-綜合征（“貓”叫綜合征）

1.發(fā)病率：為1/50000，在常染色體結(jié)構(gòu)畸變中占首位大部分患者能活到兒童期，少數(shù)可到成年

2.臨床表現(xiàn)：患兒在嬰幼兒時期的哭聲似小貓叫，喉部畸形、松弛，小頭，鼻塌、低耳位、牙錯位咬合，手足小，腎畸形，腦積水，肌張力亢進，智力嚴重低下。3.核型：

46,XX(XY),del(5)(p15)脆性X綜合征脆性部位(fragilesite)Xq27.3帶有一脆性斷裂點FMR-1人類染色體和染色體病FMR-1基因脆性X染色體綜合征(fraXchromosomesyndrome)n=6～46；正常n=52～200；前突變n=200～230；患者5CGGCGGCGGCGGCGGCGG……臨床特征中度到重度智力低下大頭、方額，大耳、單耳輪，大下頜且前突語言障礙，性情孤僻性成熟后睪丸比正常人大一倍以上多數(shù)患者青春期前有多動癥，但隨著年齡增長而逐漸減輕第二節(jié)

染色體病的分子生物學檢驗技術1.熒光原位雜交技術2.多重連接依賴性探針擴增檢測技術3.比較基因組雜交檢測技術4.無損傷產(chǎn)前染色體病分子生物學檢驗技術一.熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）原位雜交（ISH）原位雜交(insituhybridization,ISH)

將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交。使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。基本原理

根據(jù)堿基互補配對原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DAN的存在與定位。原位雜交技術種類基因組原位雜交技術

熒光原位雜交技術

多彩色熒光原位雜交技術

原位PCR3H、35S、125I、32P等原位雜交常用標記物質(zhì)70年代80年代中后期放射性同位素12熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)2一、熒光原位雜交技術

熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子(reportermolecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料。（一）FISH的基本原理FISH基本原理是利用同源互補的待檢染色體與用熒光標記過的核酸探針，經(jīng)變性-退火-復性，形成待檢DNA與核酸探針的雜交體。使探針與熒光素標記的特異親和素之間發(fā)生免疫化學反應，最后用熒光顯微鏡對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。對于較大片段的靶核酸序列直接采用熒光標記的核酸探針，對于較小的靶核酸序列先用生物素或地高辛標記探針，再用熒光標記的單克隆抗體進行免疫化學檢測二、FISH技術的特點

多彩色熒光原位雜交FISH樣本的制備探針的制備探針標記雜交（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測結(jié)果分析實驗流程（三）FISH技術的基本方法1.染色體結(jié)構(gòu)數(shù)目異常的檢測

產(chǎn)前診斷中對常見非整倍體異常分析（五）FISH技術應用2.基因在染色體的定位3.RNA表達的定性、定位及定量分析核型分析，雖可以準確檢查胎兒染色體是否存在數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常，是產(chǎn)前診斷金標準，但時間長，2~4周。FISH在臨床中的應用常見非整倍體異常的檢測分析一些顯帶技術不易分辨的染色體異常人類基因在染色體上的定位原癌基因的定位病毒基因組在染色體中的整合5個FISH診斷項目二、多重連接依賴性探針擴增檢測技術（Multiplexligation-dependentprobeamplicaiton,MLPA）5’3’通用引物序列Y通用引物序列X靶序列雜交序列靶序列雜交序列MLPA原理

每個MLPA探針含有兩個熒光標記的寡核苷酸片段

包括：通用