現(xiàn)代生物技術(shù)課件 2蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程(proteinengineering）李信民西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系Email:5372009443@例：干擾素是由效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，可阻斷細(xì)胞分裂間期，抑制DNA復(fù)制，可用于治療疾病。不足：半衰期短，體外難保存，作用弱?，F(xiàn)有蛋白質(zhì)不能滿足人類的需要

第一節(jié)概述在基因工程技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合上世紀(jì)80年代初期出現(xiàn)的蛋白質(zhì)晶體學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù),則誕生了第二代基因工程──蛋白質(zhì)工程、生物工程領(lǐng)域中新興的一門學(xué)科。蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的基礎(chǔ)1．蛋白質(zhì)化學(xué)的進(jìn)展是理論基礎(chǔ)在蛋白質(zhì)研究中，取得許多有價(jià)值的數(shù)據(jù)，有：①數(shù)千種蛋白質(zhì)被研究，了解它們功能；②1000多種蛋白質(zhì)的氨基酸序列被測(cè)定；③數(shù)百種蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)圖，了解了它們的高級(jí)結(jié)構(gòu)；④數(shù)百種蛋白結(jié)構(gòu)域(motif)、數(shù)百種蛋白功能域(domain)模式業(yè)已清楚。所有這些數(shù)據(jù)和資料都為蛋白質(zhì)的改造、修飾奠定了基礎(chǔ)。

DNA重組技術(shù)，基因工程日趨完善，可高表達(dá)目的蛋白質(zhì)；①基因突變技術(shù)，基因修飾技術(shù)為蛋白質(zhì)的改造提供了方法；②定點(diǎn)突變?nèi)諠u成熟，方法也多，已有商用試劑盒，使精確地突變蛋白質(zhì)有了可能。2．分子遺傳學(xué)方法是技術(shù)基礎(chǔ)在對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)序了解一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)及其軟件，了解了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如可對(duì)20種氨基酸鍵長(zhǎng)的大小、鍵角的方向及角度、二硫鍵的組成、位置、數(shù)目和功能可以預(yù)測(cè)，主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的形式是α螺旋和β片層。同時(shí)，也可知道蛋白質(zhì)的親水性和疏水性部位。3．蛋白質(zhì)晶體學(xué)的知識(shí)是突變的依據(jù)

蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)包括：

X線晶體衍射、核磁共振、質(zhì)譜、能譜、同步幅射、STE等技術(shù)方法，可以精確測(cè)定并繪出圖像，在了解清楚蛋白質(zhì)的三維、空間構(gòu)象的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的功能。胰島素蛋白酶光合作用受體金屬硫蛋白蜘蛛毒素

4．蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)

在溶液中，蛋白質(zhì)的一級(jí)→二級(jí)→三級(jí)→四級(jí)結(jié)構(gòu)逐步完成，蛋白質(zhì)折疊動(dòng)態(tài)變化與功能的關(guān)系也逐漸被了解。5．生物信息學(xué)（計(jì)算機(jī)輔助、信息共享）利用互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)，可利用已知的結(jié)構(gòu)域、功能域、同源模塊、折疊識(shí)別，利用2D、3D及動(dòng)畫設(shè)計(jì)。第二節(jié)蛋白質(zhì)工程的概念

1．蛋白質(zhì)工程概念（ProteinEngineering）

以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，通過(guò)化學(xué)和物理手段，對(duì)目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計(jì)進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)和構(gòu)建，最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質(zhì)更優(yōu)良、更符合人類需求的功能蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程包括蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的分析、設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)基因重組或其它手段改造或創(chuàng)造蛋白質(zhì)。2.蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別：

基因工程蛋白質(zhì)工程相同點(diǎn)都要改造基因，都屬于分子水平產(chǎn)生新的無(wú)新基因基因（型）產(chǎn)生的蛋白質(zhì)原有的新的聯(lián)系蛋白質(zhì)工程以基因工程為基礎(chǔ)，是基因工程的應(yīng)用和延伸第三節(jié)

蛋白質(zhì)工程的內(nèi)容及流程（一）對(duì)天然蛋白質(zhì)改造三個(gè)層次：小改是對(duì)天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修改。它往往利用點(diǎn)突變的技術(shù)，在維持蛋白質(zhì)原有功能的基礎(chǔ)上，改進(jìn)某一些性質(zhì)特點(diǎn)。例如，在核糖核酸酶內(nèi)部引入二硫鍵以增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性。又如，修改與胰島素分子間聚合作用有關(guān)的表面殘基，使其更容易解離成有活性的單體分子，從而使這種胰島素成為速效型藥物。中改是對(duì)蛋白質(zhì)分子中某些結(jié)構(gòu)單元或肽段進(jìn)行分子裁剪，通過(guò)基因操作，在不同的蛋白質(zhì)分子之間替換結(jié)構(gòu)單元，以期得到新的功能組合。例如:是將小鼠的抗體蛋白分子上識(shí)別抗原的部分，與人抗體分子上引起免疫反應(yīng)的功能部分，通過(guò)基因拼接的辦法結(jié)合在一起，得到的嵌合分子既具有鼠的抗體抗原專一性，能引起人的免疫反應(yīng)、同時(shí)又不會(huì)引起人體排異反應(yīng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值，可能提供一條途徑，即利用鼠的抗體，通過(guò)蛋白質(zhì)工程來(lái)生產(chǎn)能為人體所用的抗體。大改

是重新設(shè)計(jì)與合成自然界本不存在的蛋白質(zhì)分子。即從蛋白質(zhì)的氨基酸組成和順序出發(fā)，設(shè)計(jì)并制造出一個(gè)全新的蛋白質(zhì)，并使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的功能。蛋白質(zhì)工程流程圖基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)期蛋白質(zhì)功能分子設(shè)計(jì)DNA合成（二）研究的核心內(nèi)容1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)3.蛋白質(zhì)的改造和創(chuàng)造收集蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息以建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定晶體學(xué)的技術(shù)：制備單晶體，然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、計(jì)算和分析。核磁共振技術(shù)可分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過(guò)了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點(diǎn)，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析生物信息學(xué)應(yīng)用研究–分子模型Purification,characterization,andmolecularcloningofthegeneofaseed-specificantimicrobialproteinfrompokeweed.

2.結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)

根據(jù)對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來(lái)的數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過(guò)基因重組等實(shí)驗(yàn)可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時(shí)存在兩個(gè)原子等基本原則分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。這方面的工作尚在起步階段1.蛋白質(zhì)改造和創(chuàng)造的途徑（1）物理、化學(xué)法：對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團(tuán)，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等。

3.蛋白質(zhì)的改造和創(chuàng)造2）生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。以上方法只能對(duì)相同或相似的基團(tuán)或化學(xué)鍵發(fā)生作用，缺乏特異性，不能針對(duì)特定的部位起作用。3）采用基因重組技術(shù)或人工合成DNA，不但可以改造蛋白質(zhì)而且可以實(shí)現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì)（1）分離純化目的蛋白，已知功能的易于研究。（2）測(cè)序，晶體衍射等，獲得結(jié)構(gòu)與蛋白功能的關(guān)系。（三）蛋白質(zhì)改造和創(chuàng)造的內(nèi)容（3）通過(guò)蛋白/基因序列，設(shè)計(jì)突變引物、探針，從基因cDNA文章調(diào)出的基因cDNA。（4）設(shè)計(jì)改造方案，目的要明確，意欲改變的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。（5）對(duì)基因進(jìn)行突變（定點(diǎn)特異突變）（6）構(gòu)建表達(dá)突變了的基因重組體，并進(jìn)行表達(dá)。（7）分離、純化、生物學(xué)或能測(cè)定。（8）商品化。

1.任務(wù)：

目前主要集中在對(duì)天然蛋白質(zhì)（酶）作以10個(gè)方面改變，克服缺點(diǎn)，擴(kuò)大增添優(yōu)點(diǎn)。其長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)是創(chuàng)造人類所需各種性能優(yōu)越的人造蛋白質(zhì)。（四）蛋白質(zhì)工程任務(wù)及切入點(diǎn)1)提高蛋白的生物活性，酶催化、抗體中和、激素調(diào)控代謝、細(xì)胞因子抗病毒及免疫調(diào)節(jié)活性。2)增加蛋白生理功能專一性，如酶、抗體等配基和配體相結(jié)合作用的專一性。3)改變蛋白質(zhì)種屬特異性，應(yīng)用不受限。4)提高蛋白抗氧化能力。5)延長(zhǎng)蛋白代謝半衰期，如EPO，tPAIL-2。6)增強(qiáng)某些蛋白抗酶能力，提高效率，利于純化。7)改變蛋白對(duì)pH值離子強(qiáng)度設(shè)定范圍，改變蛋白作用條件。8)提高對(duì)溫度的穩(wěn)定性。9）提高酶離子催化效率，改變酶促反應(yīng)的速度。10）改變酶的機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)，減少反饋抑制；改變酶的結(jié)構(gòu)。不再加入輔助因子。這在工業(yè)大生產(chǎn)中是常要考慮的問(wèn)題。

主要有兩個(gè)方面：根據(jù)需要確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系，通過(guò)基因改造，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；在此基礎(chǔ)之上，實(shí)現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)。2.蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)

應(yīng)注意①定點(diǎn)突變注意盡量保護(hù)保守的殘基，特別在高特異性、高活性蛋白操作時(shí)更應(yīng)注意。②對(duì)糖蛋白的N糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser/The-X-Pro）應(yīng)予注意。分泌蛋白、穿膜蛋白的這些位點(diǎn)若改變，將影響其糖基化，則可能對(duì)生物活性有影響。故注意對(duì)天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸加以保護(hù)。

③疏水氨基酸常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)活性中心區(qū)，故應(yīng)保留脯氨酸（可終止α螺旋區(qū)），半胱氨酸（形成二硫鍵，這是分泌蛋白標(biāo)志之一）。④α螺旋，β折疊區(qū)一般不會(huì)存在酶的活性中心及底物的結(jié)合中心，只是結(jié)構(gòu)支架。而環(huán)區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)和帶電荷區(qū)多位蛋白質(zhì)表面，可能是底物結(jié)合區(qū)和配基結(jié)合部位，應(yīng)予注意。⑤對(duì)于有內(nèi)含子的基因序列，可以試著去刪除某一外顯子，觀察對(duì)功能影響。由于單個(gè)外顯子一般編碼獨(dú)立折疊結(jié)構(gòu)刪去后不會(huì)影響其余部分的折疊。⑥構(gòu)建嵌合蛋白時(shí)，若是同源蛋白嵌合體（30%同源），結(jié)合部應(yīng)是相同或相近功能氨基酸；若是非同源原蛋白質(zhì)，接合部應(yīng)在預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的邊緣。⑦缺失突變，盡量不用天然存在RE酶切位點(diǎn)進(jìn)行刪除，因?yàn)槟菢涌赡軙?huì)破壞正確的ORF或影響蛋白質(zhì)折疊。⑧若是對(duì)結(jié)構(gòu)一無(wú)所知，可采用隨機(jī)插入六聚體接頭研究功能性結(jié)構(gòu)域，由于只插入2個(gè)氨基酸，對(duì)整體功能破壞較輕。目標(biāo) 措施 舉例

熱穩(wěn)定性↑ 增加分子內(nèi)二硫鍵，

調(diào)整分子內(nèi)疏水基因作用溶菌酶

抗氧化能力↑Cys→Ser，色氨酸→酪氨酸蛋白水解酶

改變酶學(xué)性質(zhì)改進(jìn)酶的最適PH，專一性，

置換分子內(nèi)部分氨基酸

增加pH穩(wěn)定 調(diào)整分子內(nèi)帶電荷基因 葡萄糖異構(gòu)酶

抗金屬離子 Cys→Ser

過(guò)氧化酶 蛋白質(zhì)工程某些目標(biāo)可采取措施第四節(jié)

實(shí)際應(yīng)用

1.提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

2.融合蛋白質(zhì)

3.蛋白質(zhì)活性的改變

4.治癌酶的改造

5.嵌合抗體和人緣化抗體

天然酶雖然在生物體內(nèi)能發(fā)揮各種功能，但在生物體外，特別是在工業(yè)極端條件（如高溫、高壓、機(jī)械力、重金屬離子、有機(jī)溶劑、氧化劑、極端pH等）下，則常易遭到破壞。

蛋白酶的蛋白質(zhì)工程實(shí)例1:枯草桿菌堿性蛋白酶(重要工業(yè)用酶)對(duì)堿、熱、氧化作用抗力差，易失活。Met/Ala(222),成功地制備出具有耐堿、耐熱以及抗氧化的各種新特性的蛋白酶。

實(shí)例2：胰蛋白酶（Lys-Arg）易自溶失活對(duì)自溶片段分析，對(duì)Arg117進(jìn)行設(shè)計(jì)，引入缺失突變。穩(wěn)定性大大提高。表面電荷正改負(fù)，在較高pH條件下提高了其專一性（Lys-Arg）。葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對(duì)GI基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長(zhǎng)一倍；最適反應(yīng)溫度提高10～12℃；酶比活相同。

2.融合蛋白質(zhì)

腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子?；瘜W(xué)合成EnkN端5肽編碼區(qū)，通過(guò)連接3肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性顯著高于單純的IFN，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)阻斷實(shí)驗(yàn)證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。

設(shè)計(jì)速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長(zhǎng)因子－I(IGF－I)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但I(xiàn)GF－I不形成二聚體。IGF－I的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對(duì)應(yīng)）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)。改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍胰島素改造

天然胰島素制劑在儲(chǔ)存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)。

癌癥的基因治療分二個(gè)方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，提高化療劑量。單純皰癥病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可催化胸腺嘧啶和其類似物如無(wú)環(huán)鳥苷磷酸化。缺少3’端羥基，可終止DNA的合成，從而殺死癌細(xì)胞。基因突變可提高HSV－TK催化的能力。從大量的隨機(jī)突變中篩選，在酶活性部位附近替換

6個(gè)氨基酸，催化能力分別提高43和20倍。嵌合抗體和人源化抗體

免疫球蛋白由二條重鏈和二條輕鏈通過(guò)二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)（N端）和恒定區(qū)（C端），抗原的吸附位點(diǎn)在可變區(qū)，細(xì)胞毒素或其他功能因子的吸附位點(diǎn)在恒定區(qū)。每個(gè)可變區(qū)中有三個(gè)部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在β折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)（CDR），是抗原的結(jié)合位點(diǎn)，其余部分為CDR的支持結(jié)構(gòu)。不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)抗體進(jìn)行改造。嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌的單克隆抗體Mab17－1A。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問(wèn)題，但仍有幾種嵌合抗體通過(guò)了臨床實(shí)驗(yàn)。

人源化抗體就是將鼠源抗原識(shí)別區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將CDR轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原識(shí)別和結(jié)合能力很小，必須帶上幾個(gè)框架氨基酸殘基，才能保持原有的結(jié)合力。這樣就存在免疫原性與抗原結(jié)合力之間的矛盾。通過(guò)逐個(gè)氨基酸替代或計(jì)算機(jī)模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎(chǔ)之上，盡可能地降低免疫原性。第一個(gè)臨床上應(yīng)用的用于治療淋巴肉芽腫病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人源化抗體CAMPATH－1H，療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應(yīng)。而其他人源化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應(yīng)可以忽略不計(jì)。

表16-2應(yīng)用蛋白質(zhì)工程已取得的研究成果實(shí)例

─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────誘變蛋白質(zhì)

氨基酸突變

原定目標(biāo)

結(jié)果─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────T4溶菌酶

Ilu→Cys

構(gòu)建二硫鍵

成功

增加熱穩(wěn)定性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────枯草桿菌Gly→Lys

拓寬酶作用的成功蛋白酶底物范圍

Ala→Leu

提高抗氧化性能────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────α-抗凝酶

Met→Val提高抗氧化性能

成功─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────胰蛋白酶

Gly→Ala

提高酶水解專一性

成功

─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-內(nèi)酰胺酶

Ser→Cys

驗(yàn)證Ser對(duì)該酶成功的重要性─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────β-干擾素

Cys→Ser

提高穩(wěn)定性

成功

────────────────────────────────────────────────────