獸醫(yī)生物制品制造-診斷制劑制造（獸醫(yī)生物制品技術(shù)）

補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原及其制備1.補(bǔ)體

是動物血清中的一種不耐熱物質(zhì)，用于補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。在補(bǔ)體的參與下可明顯的提高抗原、抗體特異性反應(yīng)的敏感性。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原及其制備2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

反應(yīng)系統(tǒng)指示系統(tǒng)反應(yīng)結(jié)果的判定已知抗原（抗體）待檢血清（抗原）綿羊紅細(xì)胞溶血素如溶血則為陰性如不溶血則為陽性補(bǔ)體補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原及其制備3.獸用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原鼻疽補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原布魯氏菌補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原馬傳染性貧血補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原鉤端螺旋體補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原及其制備4.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原制備細(xì)菌培養(yǎng)物高壓滅菌或水浴滅活離心沉淀物冷暗處0.5%石炭酸生理鹽水浸泡上清液補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原一定時間常用的變態(tài)反應(yīng)抗原引起變態(tài)反應(yīng)的抗原物質(zhì)稱為變態(tài)反應(yīng)抗原（變應(yīng)原），如鼻疽菌素、結(jié)核菌素和布氏桿菌水解素等。常用的變態(tài)反應(yīng)抗原1.布魯氏菌水解素是變態(tài)反應(yīng)原性良好的弱毒布魯氏菌水解物，專用于綿羊和山羊布氏菌病的變態(tài)反應(yīng)診斷。羊的皮膚變態(tài)反應(yīng)在愈后1-1.5年才消失，所以對污染羊群檢出率高于血清學(xué)方法。常用的變態(tài)反應(yīng)抗原2.結(jié)核菌素是結(jié)核菌菌體成分,由koch于1890年首創(chuàng)的一種用于診斷結(jié)核病的生物制品，至今仍被廣泛應(yīng)用。此后許多學(xué)者又制備了50多種結(jié)核菌素，其中僅Koch氏的舊結(jié)核菌素（OT）及Seibert氏制備的純蛋白衍生物（PPD）診斷價值高。常用的變態(tài)反應(yīng)抗原3.鼻疽菌素動物在感染鼻疽后2-3周,即出現(xiàn)對變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)，而且持續(xù)時間較長，一般可保持十年以上，有的可持續(xù)發(fā)生。鼻疽的變應(yīng)原稱為鼻疽菌素。常用的變態(tài)反應(yīng)抗原4.粗制變態(tài)反應(yīng)抗原制備病原菌甘油肉湯2-4個月高壓滅菌過濾濾液粗抗原常用的變態(tài)反應(yīng)抗原5.提純變態(tài)反應(yīng)抗原制備病原菌無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基2-4個月高壓滅菌過濾濾液4%三氯醋酸沉淀物1%三氯醋酸離心洗滌沉淀物3次pH7.4PBS蛋白質(zhì)含量測定分裝或凍干備用沉淀反應(yīng)抗原及其制備1.概念為膠體狀態(tài)的可溶性抗原(細(xì)菌和寄生蟲的浸出液、培養(yǎng)濾液、組織浸出液、動物血清和動物蛋白等)，與相應(yīng)抗體相遇，在二者比例合適并有電解質(zhì)存在時，抗原抗體相互交聯(lián)形成的免疫復(fù)合物達(dá)到一定大小時，即出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。傳染性法氏囊抗原、抗體特異性結(jié)合出現(xiàn)的沉淀線白色沉淀線沉淀反應(yīng)抗原及其制備2.種類（1）按使用方法不同環(huán)狀反應(yīng)抗原，如炭疽動物臟器抗原。絮狀反應(yīng)抗原，如測定抗毒素效價的絮狀反應(yīng)抗原。瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原，如雞傳染性法氏囊病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原；免疫電泳抗原等。沉淀反應(yīng)抗原及其制備（2）按病原體的不同和制備材料的不同細(xì)菌沉淀抗原病毒沉淀抗原沉淀反應(yīng)抗原及其制備（3）畜禽沉淀反應(yīng)抗原①雞傳染性法氏囊病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原②雞馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原③標(biāo)準(zhǔn)炭疽抗原④馬傳染性貧血瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)抗原沉淀反應(yīng)抗原及其制備3.沉淀反應(yīng)抗原制備（1）細(xì)菌沉淀抗原制備培養(yǎng)物滅菌研磨菌粉0.5%石炭酸生理鹽水浸泡過濾抗原（濾液）沉淀反應(yīng)抗原及其制備（2）病毒沉淀抗原制備病毒動物收獲含毒量高的組織制成勻漿裂解細(xì)胞浸毒反復(fù)上清液滅活沉淀抗原接種一定時間PBS液4℃-20℃甲醛離心放射性同位素標(biāo)記抗體及其制備免疫放射分析(IMRA)，是一種用放射性同位素標(biāo)記抗體的新的分析技術(shù)，具有高度敏感性、精確性和特異性。放射性同位素標(biāo)記抗體指放射性同位素與抗體結(jié)合形成的結(jié)合物。目前多使用同位素碘作標(biāo)記，125I半衰期較長(60天)、同位素豐度大、輻射損傷小和計數(shù)率較高。放射性同位素標(biāo)記抗體及其制備放射物標(biāo)記中最常用的是外標(biāo)記，碘標(biāo)記的方法很多，最常用氯胺T法，抗體IgG比較穩(wěn)定，碘化后架存期較長。放射性同位素標(biāo)記抗體及其制備碘化IgG程序（1）先將提純的免疫抗體IgG與同位素125Ⅰ置試管中（2）再加入氯胺T。由于碘化反應(yīng)進(jìn)行很快，故碘及氯胺T必須在攪拌下加入，以免碘化不均勻.放射性同位素標(biāo)記抗體及其制備（3）約5min后加入還原劑偏重亞硫酸鈉，阻斷氯胺T作用以終止碘化反應(yīng)，再加入碘化鉀作為碘離子的載體，以減少蛋白分子吸附試劑中數(shù)量不穩(wěn)定的放射性碘離子。放射性同位素標(biāo)記抗體及其制備（4）最后用過葡聚糖G50柱等方法將游離碘及其他放射性雜質(zhì)與標(biāo)記抗體分開。酶標(biāo)記抗體及其制備1.概念以與底物結(jié)合后能顯色的酶與抗體連接后所制備的結(jié)合物稱為酶標(biāo)記抗體。2.作用可與被檢抗原形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物。結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶,在遇到相應(yīng)的底物時,催化無色的底物,使其水解、氧化或還原,生成可溶性或不溶性的有色產(chǎn)物。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及濃度,可對抗原作定性、定位和定量檢測。酶標(biāo)記抗體及其制備3.用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶(AP)等。國內(nèi)多采用HRP,在催化反應(yīng)中,使H2O2分解釋放出新生態(tài)氧,將底物氧化成有色產(chǎn)物。HRP常用底物有鄰苯二胺(OPD)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)和3.3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)等。該類制劑主要用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA試驗(yàn))。酶標(biāo)記抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA試驗(yàn))酶標(biāo)記抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA試驗(yàn))酶標(biāo)記抗體及其制備4.酶標(biāo)記抗體的制備戊二醛一步法戊二醛二步法過碘酸鈉氧化法酶標(biāo)記抗體及其制備5.過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)抗體（1）原理HRP含18%碳水化合物，過碘酸鈉將酶分子表面的多糖鏈氧化為醛基，用硼氫化鈉中和多余的過碘酸。酶上的醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。酶標(biāo)記抗體及其制備（2）標(biāo)記步驟①稱取5mgHRP溶于1.0ml新配制的0.3mol/LpH8.1的NaHCO3溶液中；②滴加0.1ml1%2，4-二硝基氟苯無水乙醇溶液，室溫避光輕輕攪拌1h；③加入1.0ml0.06mol/L過碘酸鈉水溶液，室溫輕攪30min；④加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫避光輕攪1h，然后裝入透析袋中；酶標(biāo)記抗體及其制備⑤于1000mlpH9.50.01mol/L碳酸鈉緩沖液中，4℃透析過夜，其間換液3次；⑥吸出透析袋中液體，加入每毫升含IgG5mg的pH9.50.01mol/L碳酸鈉緩沖液1ml，室溫避光輕輕攪拌2～3h；⑦加硼氫化鈉5mg，置4℃3h或過夜；⑧逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，置4℃1h后，4000r/min離心15min，棄上清，沉淀，再用50%飽和硫酸銨沉洗2次；⑨沉淀物溶于少量pH7.40.01mol/L磷酸緩沖鹽水液，裝入透析袋，以同樣緩沖鹽水液充分透析至無銨離子，1000r/min離心30min，上清液即為酶標(biāo)記抗體。凝集反應(yīng)抗原及其制備1.概念顆粒性抗原,如細(xì)菌和紅細(xì)胞等,在有電解質(zhì)存在條件下,能與特異性抗體結(jié)合,形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。凝集反應(yīng)抗原及其制備2.種類布氏桿菌凝集反應(yīng)抗原(試管、平板和全乳環(huán)狀凝集反應(yīng)抗原)雞白痢全血凝集反應(yīng)抗原凝集反應(yīng)抗原及其制備3.凝集抗原制備的基本程序選擇菌株接種培養(yǎng)基培養(yǎng)收獲細(xì)菌滅活過濾濾液離心細(xì)菌沉淀稀釋成規(guī)定濃度檢驗(yàn)標(biāo)化合格熒光素標(biāo)記抗體及其制備1.熒光素是一種染料,在紫外光、藍(lán)紫光等短波光照射下被激發(fā)釋放出波長較長的可見光,稱為熒光。2.常用的熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)。熒光素標(biāo)記抗體及其制備3.作用熒光抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后,在紫外光或藍(lán)紫光等照射下,標(biāo)記抗體上的熒光素發(fā)出熒光,通過熒光顯微鏡檢測熒光強(qiáng)度和熒光現(xiàn)象，可知抗原的存在及部位，依熒光強(qiáng)弱也可測知抗原量的差異。熒光素標(biāo)記抗體及其制備例：直接法：將待測標(biāo)本固定于玻片表面，滴加已知熒光抗體后再以緩沖液沖洗，干燥后于熒光顯微鏡下觀察。

(1)過程：+待測抗原熒光素+抗體熒光抗體(一段時間后沖洗)熒光鏡檢測結(jié)果

(2)結(jié)果：陽性—可見帶熒光的抗原抗體復(fù)合物陰性—無熒光

(3)用途：用以檢測病毒感染細(xì)胞、細(xì)菌和沉積于組織中的免疫復(fù)合物等。

(4)特點(diǎn)：簡單、特異性高；敏感性低、每檢一種抗原就需要制備一種熒光抗體。熒光素標(biāo)記抗體及其制備熒光素標(biāo)記抗體及其制備熒光素標(biāo)記抗體及其制備

免疫熒光熒光素標(biāo)記抗體及其制備4.熒光素標(biāo)記抗體制備（1）將提純抗體用冷pH7.2PBS稀釋成10-20mg/ml的濃度。（2）按蛋白量的1/80-1/100加入FITC,先用pH9.50.5M碳酸鹽緩沖液溶解FITC,于5min內(nèi)滴加到抗體球蛋白溶液中。（3）最后補(bǔ)加碳酸鹽緩沖液,使其總量為抗體球蛋白溶液量的1/10。熒光素標(biāo)記抗體及其制備（4）4℃攪拌標(biāo)記12-15h(20-25℃、1-2h)。（5）用大量的pH7.2PBS透析4h,用葡萄糖凝膠濾除標(biāo)記抗體中游離熒光素,通過DEAE纖維素層析除去過高標(biāo)記和未標(biāo)記的蛋白分子。（6）測定效價和特異性，分裝保存。診斷制劑1.概念診斷制劑：利用微生物和寄生蟲培養(yǎng)物、代謝物、組分（提取物）和反應(yīng)物等有效物及動物血清等材料制成的，專門用于動物傳染病和寄生蟲病診斷和檢疫的一大類制品,又稱為診斷液。主要有診斷用抗原、診斷用抗體(血清)2類。診斷制劑2.基本要求特異性強(qiáng)、敏感度高。3.用于診斷的原理是基于抗原抗體能特異性結(jié)合這一基本特性。故診斷中可以用已知抗原檢測未知抗體，或用已知抗體檢測未知抗原。診斷制劑4.種類診斷制劑診斷用抗原診斷用抗體血清反應(yīng)抗原變態(tài)反應(yīng)抗原凝集反應(yīng)抗原沉淀反應(yīng)抗原補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原診斷血清單克隆抗體標(biāo)記抗體診斷制劑的分類診斷制劑診斷用抗原診斷用抗體血清反應(yīng)抗原變態(tài)反應(yīng)抗原凝集反應(yīng)抗原沉淀反應(yīng)抗原補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原診斷血清單克隆抗體標(biāo)記抗體診斷制劑的分類1.診斷抗原（1）血清反應(yīng)抗原概念：是用已知微生物和寄生蟲及其組分或浸出物、代謝產(chǎn)物、感染動物組織制成，用以檢測血清中的相應(yīng)抗體。診斷制劑的分類特點(diǎn)：此類制劑可與血清中的相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成可見或可以測知的復(fù)合物，以確診動物是否受微生物感染或接觸過某種抗原。常用的抗原：凝集反應(yīng)抗原沉淀反應(yīng)抗原補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原診斷制劑的分類（2）變態(tài)反應(yīng)抗原變態(tài)反應(yīng)：細(xì)胞內(nèi)寄生菌（如布魯氏菌、結(jié)核桿菌、鼻疽桿菌等）在傳染過程中引起以細(xì)胞免疫為主的變態(tài)反應(yīng)，即感染機(jī)體再次遇到同種病原菌或其代謝產(chǎn)物時出現(xiàn)一種具有高度特異性和敏感性的異常反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)應(yīng)用：常用以診斷某些傳染病。診斷制劑的分類變態(tài)反應(yīng)抗原：引起變態(tài)反應(yīng)的抗原物質(zhì)稱為變應(yīng)原（變態(tài)反應(yīng)抗原）。臨床上的變態(tài)反應(yīng)抗原：鼻疽菌素結(jié)核菌素布魯氏菌水解素診斷制劑的分類2.診斷抗體（1）診斷血清概念：是利用血清反應(yīng)以鑒別微生物、鑒定病原血清型或診斷傳染病的一種含已知的特異性抗體的血清。多價診斷血清單價血清或稱因子血清H血清O血清K血清診斷制劑的分類（2）單克隆抗體多克隆抗體：血清中的抗體一般是由多個抗原決定蔟刺激不同B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的，故稱之為多克隆抗體。單克隆抗體：指由一個B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生的針對單一抗原決定蔟的抗體。診斷制劑的分類由于這種抗體是不均一的，無論是對抗體分子結(jié)構(gòu)與功能的研究或是臨床應(yīng)用都受到很大限制，因此稱為第一代抗體；如何能獲得均一性抗體成為關(guān)注的問題。診斷制劑的分類PcAb McAb產(chǎn)生細(xì)胞 多種漿細(xì)胞克隆一種漿細(xì)胞克隆特異性低 高敏感性低高均一性無有純度低高重復(fù)性個體差異高成本高低多抗與單抗的區(qū)別診斷制劑的分